邓玉霞, 颜 云, 王成海, 於晓平, 卢 丹

(1. 扬州大学临床医学院 妇产科, 江苏 扬州, 225009;2. 江苏省宝应县人民医院 妇产科, 江苏 宝应, 225800;3. 扬州大学医学院 病理教研室, 江苏 扬州, 225009;4. 扬州大学附属医院 健康体检中心, 江苏 扬州, 225009)

宫颈癌是最常见的妇科癌症，该病主要由持续性宫颈癌人乳头瘤病毒(HPV)感染导致，目前认为长期宫颈炎会增加HPV感染概率，进而发生癌变[1]。超保守RNA uc.189是一种非编码RNA, 定位于人类染色体6p21上。研究[2-3]表明uc.189在女性恶性肿瘤中的表达水平升高，提示该病患者的预后较差。食管癌的uc.189与食管鳞状细胞癌(ESCC)的浸润深度、转移及分期密切相关，但uc.189以外泌体形式对宫颈鳞状细胞癌影响的研究较少。本研究采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 和电镜检测uc.189及其外泌体在子宫颈鳞癌细胞的表达情况，探讨uc.189的临床病理学意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

58例子宫颈癌组织及邻近正常宫颈组织标本均来源于扬州大学附属医院及苏北人民医院妇科手术患者，标本来源时间为 2019年1月—2020年11月，年龄48～73 岁，中位年龄为 61岁。所有患者术前未经过放射治疗和药物治疗。子宫颈鳞状细胞癌由扬州大学附属医院病理科医师明确诊断。癌症样本的实验运用及临床参数的收集均经扬州大学医学院伦理委员会批准，且患者签署知情同意书。新鲜子宫颈鳞状细胞癌组织采集后立即放入液氮罐，于-80 ℃冰箱内长期保存。

1.2 qRT-PCR

首先，萃取子宫颈鳞癌组织总RNA, 通过逆转录酶将RNA逆转录成cDNA, 然后使用 Takara 生物公司qRT-PCR反应试剂盒。反应体系为50 μL, cDNA为1 μL, 12 × SYBR Premix ExTaqTMII 50 μL, 上下游引物各1 μL, 加水调整反应体系至50 μL, 每组样本有3组复孔，内参为U6(uc.189和U6的引物序列见表1)。最后在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system仪器上进行qRT-PCR反应，读取Ct 值，结果以 2-ΔΔCt计算。

表1 荧光定量引物信息表

1.3 外泌体的检测和验证

1.3.1 外泌体的电镜检测：采用电镜技术对宫颈癌组织中外泌体进行检测，将肿瘤组织研磨成粉末溶解于12 mL培养液中，然后与ExoQuickTM试剂盒中的外泌体沉淀液混合，并根据试剂盒说明书步骤分离外泌体。分离的外泌体用2%戊二醛固定，加载到碳涂层网格上，透射电镜观察(放大倍数250k×)。外泌体计数方法: 电镜下对鳞状细胞癌组和癌旁正常组织的每个组织片随机取5个视野，统计并计数外泌体数量，并比较2组的差异。

1.3.2 外泌体的蛋白免疫印迹法(Western blot)验证: Western blot实验步骤参考已经发表的文章中所述[4]。主要使用的验证抗体有：抗CD9(#ab2215, Abcam公司)、抗CD81(#ab109201, Abcam公司)和内参抗体GAPDH(#2118, CST公司)。

1.4 uc.189外泌体含量与临床病理参数相关性分析

对58例宫颈癌患者的临床病理资料进行整理，包括患者年龄、性别、HPV感染、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移和TNM分期。统计uc.189外泌体的含量与临床病理参数的相关性。根据宫颈鳞癌组织中uc.189外泌体的含量，将其分为高含量组和低含量组，分组依据: 高含量组数值>对照组数值，低含量组数值<实验对照组数值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件对临床病理数据进行统计分析，采用Microsoft Office Excel 2007软件数据进行绘制。计量资料2组间比较采用配对样本t检验，计数资料比较采用χ2检验分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 uc.189在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达情况

采用qRT-PCR对 uc.189 RNA在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达进行检测。结果表明，相对于58例癌旁正常宫颈黏膜组织(对照组)的(1.12±0.66), uc.189 RNA在宫颈鳞状细胞癌组织(n=58)中的表达水平为(4.47±1.10), 见图1A。58例宫颈鳞癌中，有淋巴结转移41例(转移组)，无淋巴结转移17例(非转移组); 与非转移组(3.36±0.82)相比, uc.189 RNA在转移组中的表达水平显著升高，为(4.92±0.85), 见图1B。

A: uc.189 RNA在宫颈组织中的表达。与对照组相比, **P<0.01。B: uc.189 RNA在宫颈鳞癌转移组中的表达。与非转移组相比, *P<0.05。

2.2 uc.189外泌体电镜检测结果

uc.189外泌体是一个圆形或椭圆形囊泡，染色为灰黑色或黑色，直径为40～100 nm。在宫颈鳞癌组中, uc.189外泌体的数量为(11.16±5.66)多于对照组的(2.21±1.39), 差异有统计学意义(t=12.51,P<0.01), 见图2。

A: 外泌体形态图(放大倍数250万倍); B: 外泌体数量图。与对照组比较, ∗∗P<0.01。图2 宫颈癌中uc.189外泌体形态和数量电镜图

2.3 uc.189外泌体的验证

运用qRT-PCR明确外泌体中包含uc.189, 同时运用Western blot验证灰黑色圆形或椭圆形囊泡是外泌体，主要是检测外泌体的标志物CD9和CD81。实验结果显示，宫颈鳞癌组织的外泌体含有丰富的uc.189 RNA, 与对照组相比，宫颈鳞癌组的外泌体中uc.189 RNA的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05), 见图3A。Western blot 实验检测出外泌体的标志物CD9和CD81, 内参为GAPDH, 见图3B, 外泌体中CD9和CD81的蛋白量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果说明，宫颈癌细胞能产生丰富的uc.189外泌体，参与了宫颈癌的发生、发展。

2.4 uc.189外泌体含量与临床病理参数的相关性

分析结果显示, uc.189外泌体的高含量组与分化程度(P=0.004)、淋巴结转移(P=0.001)、TNM分期(P=0.003)密切相关，而uc.189外泌体的高含量组与患者的年龄(P=0.781)、HPV感染(P=0.397)和肿瘤大小(P=0.252)均无关联，见表2。

表2 宫颈鳞癌组织中uc.189外泌体的含量及其意义

3 讨 论

宫颈癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤之一[1], 是由子宫颈慢性炎逐渐癌变转化而来。研究[4]表明该病与HPV感染有关。转移和复发往往是宫颈癌患者预后不良的主要原因，具体的癌变机制目前还未彻底阐明。因此，研究宫颈癌的发生机理、寻找诊断指标和治疗靶点变得尤为重要。外泌体是由细胞分泌到细胞外的内源性盘状囊泡[5], 内容含有各种RNA 和蛋白质，直径40～100nm[6-9]。在正常及病理状态下，正常细胞和恶性肿瘤细胞均可分泌外泌体[10-11]。这种细胞外囊泡可在细胞之间传递通讯信息，并能作为膜和细胞溶质蛋白、脂质和RNA细胞之间的载体[12]。目前，已知外泌体的功能包括参与机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方面[13-14]。

A: 对照组和宫颈癌组uc.189 RNA表达水平图; B: Western blot 检测外泌体标志物图。与对照组比较, ∗P<0.05。图3 uc.189外泌体的验证

本研究通过qRT-PCR实验得出, 58例宫颈鳞癌组织中uc.189表达水平显著上调，转移组中uc.189表达水平显著更高，说明uc.189可能参与了宫颈癌的发生发展，是一种新的促癌基因。电镜观察结果显示，在宫颈鳞癌组织中有大量圆形或椭圆形囊泡，染色为灰黑色或黑色，直径为30～100 nm, 符合外泌体的形态特点。qRT-PCR实验得出宫颈癌外泌体中的uc.189含量丰富，同时Western blot结果表明外泌体标志物CD9和CD81的存在，验证了圆形或椭圆形囊泡即为uc.189外泌体。此外，电镜观察外泌体计数显示，在宫颈鳞癌组织中外泌体的数量显著多于癌旁正常组织，说明宫颈癌能产生丰富的uc.189外泌体，可能参与癌症的发生、发展。本研究统计分析了uc.189外泌体的含量与患者临床病理参数的相关性。统计数据表明uc.189外泌体高含量组与宫颈鳞癌的分化程度、淋巴结转移和TNM分期密切相关，即uc.189外泌体的含量越多，宫颈鳞癌的分化程度越低，癌细胞恶性程度越高; uc.189外泌体的含量越多，癌细胞越容易从宫颈旁淋巴结转移，更易出现远处转移，且患者的预后越差，死亡率越高。这一结果提示uc.189外泌体可能作为宫颈鳞癌检测和预后判断的一种新指标。

综上所述，本实验探讨uc.189外泌体在宫颈癌中的检测情况及与患者的临床病理意义，为下一步研究其功能性变化提供理论基础，也为宫颈癌的诊断和治疗提供新的研究策略。