胡其艳

（吉林大学基础医学院，吉林 长春 130021）

肺癌的发病率及死亡率均居于其他肿瘤的首位。据统计，全球每年死于癌症的患者中，肺癌患者的占比约为20 ～25%。非小细胞肺癌是肺癌的分型之一。有研究资料显示，约有48% 的非小细胞肺癌患者存在p53 基因点突变的情况[1]。另有研究资料显示，p53 基因点突变的发生是导致肺癌的主要原因[2]。在本次研究中，笔者主要分析p53基因点突变的发生与非小细胞肺癌患者病理生理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究对象是2018 年4 月至2019 年4 月期间吉林大学附属第一医院收治的53 例非小细胞肺癌患者。在这53例患者中，有男35 例，女18 例；其平均年龄为（58.2±3.3）岁；其平均肿瘤直径为（4.6±2.8）cm；其中有33 例腺癌患者，20 例鳞癌患者；其中病理分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者有21 例，为Ⅲ～Ⅳ期的患者有32 例；其中发生淋巴结转移的患者有29 例，未发生淋巴结转移的患者有24 例。

1.2 方法

采用聚合酶链反应单链构象多态性分析法对这53 例患者进行p53 基因点突变检测，方法为：用石蜡包埋患者的病理组织，并做成石蜡标本。将石蜡标本切成2 张6 ～8 μm厚的薄片，将切好的薄片置入试管中。对薄片进行常规脱蜡处理。将处理后所得的液体进行离心处理。将离心后获取的上清液作为标本，并放在室温下干燥10 ～20 min，加入适量的消化液及蛋白酶K，然后加入等体积的氯仿与异戊醇的混合溶液对标本进行提取，再加入适量的醋酸钠。在零下20℃对标本进行过滤及15 min 的离心，取上清液。向上清液中加入适量的TE 缓冲液，以溶解其中的DNA，并放入4℃冰箱中保存。取含有200 ngDNA 的上清液（用紫外分光光度计测定DNA 的含量）作为反应模板。设计扩增p53 基因外显子引物的方案（扩增第5 外显子上游引物的顺序 为5’-TTCCTCTTCCTGCAGTACTCC-3’，扩 增 第5 外显子下游引物的顺序为5’-GCCCCAGCTGCTCACCATCG-3’；扩 增 第6 外 显 子 上 游 引 物 的 顺 序 为5’-CACTGATTGCTCTTAGGTCG-3’，扩增第6 外显子下游引 物 的 顺 序 为5’-AGTTGCAAACCAGACCTCAGG-3’；扩 增 第7 外 显 子 上 游 引 物 的 顺 序 为5’-TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC-3’，扩增第7 外显子下游引物的顺序为5’-GAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3’；扩 增 第8 外 显 子 上 游 引 物 的 顺 序 为5’-CCTAATCCTGAGTAGTGGTAA-3’，扩增第8 外显子下游引物的顺序为5’-GTCCTGCTTGCTTACCTCG-3’）。将反应模板加入灭菌的液体石蜡油中，以预防反应模板出现蒸发现象。对反应模板进行10 min 的预变性，加入冰块及Taq 酶后置在冰上。对反应模板进行30″的离心处理，取沉淀物按照设计的方案进行p53 基因外显子扩增，扩增后放置在冰上。然后，对沉淀物进行非变性聚丙烯酰胺电泳，加入银染用溶液，根据显示出DNA 带纹可确定是否存在p53 基因点突变的情况。每一例标本均取相应位置的正常肺部组织作为对照。

1.3 观察指标

观察这53 例患者发生p53 基因点突变的情况及发生p53 基因点突变与其病理分期及淋巴结转移的相关性。

1.4 统计学方法

对本次研究中的数据均采用SPSS 21.0 统计软件进行处理，计量资料用均数±标准差（± s）表示，采用t 检验，计数资料用百分比（%）表示，采用χ² 检验。以P ＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 这53 例患者发生p53 基因点突变的情况

在这53 例患者中，有27 例患者发生p53 基因点突变（其中有15 例患者发生p53 基因第5 外显子突变，有2 例患者发生p53 基因第6 外显子突变，有10 例患者发生p53基因第8 外显子突变），发生p53 基因点突变患者的占比为50.9%；有26 例未发生p53 基因点突变，未发生p53 基因点突变患者的占比为49.1%。

2.2 这53 例患者发生p53 基因点突变与其临床病理生理特征的相关性

在这53 例患者中，病理分期为Ⅰ～Ⅱ期的非小细胞肺癌患者p53 基因点突变的发生率低于病理分期为Ⅲ～Ⅳ期的非小细胞肺癌患者，P ＜0.05 ；发生淋巴结转移的非小细胞肺癌患者p53 基因点突变的发生率高于未发生淋巴结转移的非小细胞肺癌患者，P ＜0.05。详见表1 和表2。

表1 这53 例患者中不同病理分期的患者发生p53 基因点突变的情况[n（%）]

表2 这53 例患者中淋巴结转移及未转移患者发生p53 基因点突变的情况[n（%）]

3 讨论

癌基因的变化及抑癌基因的变化在癌细胞发生恶性转变的过程中起着重要的作用。有研究资料显示，小细胞肺癌患者及非小细胞肺癌患者均存在p53 基因点突变的情况。在本次研究中，采用聚合酶链反应单链构象多态性分析法对非小细胞肺癌患者进行p53 基因点突变检测时，标本p53基因的第6 外显子扩增产物在201bP 区域出现DNA 条带，第7 外显子扩增产物在171bP 区域出现DNA 条带，获得的这两条DNA 条带的高度与设计的条带高度一致。这说明扩增p53 基因外显子成功。对非小细胞肺癌患者进行p53 基因点突变检测时使用不同的变性液（如碱变性液、甲酰胺变性液及氢氧化甲基汞变性液）对同一扩增产物进行电泳的结果发现：1）碱变性液处理获得的带纹较弱。2）甲酰胺变性液及氢氧化甲基汞变性液处理获得的带纹较为接近设计的带纹。3）使用8% 氢氧化甲基汞变性液、10% 氢氧化甲基汞变性液及8%氢氧化甲基汞变性液处理获得的条带较清晰。p53 基因是一种能与DNA 进行特异性结合的蛋白质。p53 基因具有阻滞细胞周期（G1 期～G2 期）、诱导细胞凋亡、加速细胞分化的作用。p53 基因的突变及失活可促进肿瘤的发生及发展。野生型p53 基因对细胞周期起到负性调节作用，能够抑制细胞的过度生长。突变型p53 基因可抑制细胞的生长，促进细胞的转化，进而可导致肿瘤的发生。有相关研究显示，p53 基因突变的发生存在于大多数肿瘤的发生及发展的过程中[3]。肿瘤组织发生p53 基因异常的主要原因有基因缺失、基因重组、基因突变等。常见的p53 基因突变为点突变。p53 基因发生突变时可丧失抑制肿瘤生长的功能。进行p53 基因突变检测的方法有免疫组化法、化学酶切法、聚合酶反应单链构象多态性分析法等。有学者指出，采用免疫组化法对癌组织的DNA 进行p53 基因突变检测的阳性率较高[4-5]。这可能是由于p53 基因的半衰期非常短，进行检测时肿瘤组织中的p53 基因是发生突变后的基因。有研究资料显示，采用聚合酶反应单链构象多态性分析法对肿瘤组织进行p53 基因突变检测的敏感度为81 ～92%。约有50% 的非小细胞癌患者及约有75% 的小细胞癌患者可发生p53 基因突变。p53 基因突变位点多发生在DNA 序列的保守区域中。本次研究的结果显示，在这53 例患者中，有27 例患者发生p53 基因点突变，发生p53基因点突变患者的占比为50.9%；有26 例未发生p53 基因点突变，未发生p53 基因点突变患者的占比为49.1%。这53 例患者中病理分期为Ⅰ～Ⅱ期的非小细胞肺癌患者p53基因点突变的发生率低于这53 例患者中病理分期为Ⅲ～Ⅳ期的非小细胞肺癌患者，P ＜0.05 ；发生淋巴结转移的非小细胞肺癌患者p53 基因点突变的发生率高于未发生淋巴结转移的非小细胞肺癌患者，P ＜0.05。从本次研究的结果可以看出，随着非小细胞肺癌患者病情的加重，其p53 基因点突变的发生率升高。

综上所述，p53 基因点突变的发生与非小细胞肺癌患者的病理分期及淋巴结转移的情况具有相关性。