岳 英，董锦华，肖月梅

(1.西安市胸科医院妇儿科，陕西 西安 710100；2.榆林市第二医院呼吸内科，陕西 榆林 719000)

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)作为一种最常见且预后最差的恶性肿瘤之一，严重威胁了人类健康[1-2]。尽管早期的手术、放化疗治疗等可取得较好的治疗效果，但是预后较差，大部分患者易发生远端转移，病死率较高[3]。随着研究的不断深入，人们逐渐意识到NSCLC的发展不但和肿瘤细胞自身特性相关，肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)中基质成分的变化也发挥了重要的作用。免疫细胞作为肿瘤微环境的重要组成部分，可识别肿瘤相关抗原，发挥抗肿瘤效应；但其亦可与肿瘤细胞相互作用，建立免疫耐受，进而促进肿瘤的迁移[4-6]。研究亦发现，程序性死亡受体-配体1(Programmed death ligand-1,PD-L1)蛋白在许多人类肿瘤组织异常高表达，可起到抑制肿瘤抗原特异的T细胞增殖，促其凋亡的作用，在NSCLC的发展过程中起到重要作用[7-9]。目前关于免疫细胞及在NSCLC肿瘤局部的表达及其与临床病理关系的研究较少，基于此，本研究检测了NSCLC患者肿瘤免疫微环境中T细胞、巨噬细胞比率和PD-L1的表达，并深入探讨其与肿瘤生长和转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2018年12月收治于本院肿瘤科的85例NSCLC患者为研究对象，其中男49例，女36例，平均年龄(62.50±7.78)岁。按照病理分类(WHO标准)包括腺癌56例，鳞癌29例；患者中I期40例，Ⅱ期16例，Ⅲ期20例，Ⅳ期9例；EGFR基因突变型35例，野生型50例；淋巴结转移者29例，无转移者56例。病例纳入标准：①符合病理学诊断标准；②初次诊断并接受肺癌根治手术治疗；③术前未接受过放化疗、靶向治疗；④患者年龄在40～75岁之间；⑤患者知情同意且经医院伦理委员会批准。排除标准：①患有其他恶性肿瘤患者；②患有自身免疫性疾病及严重感染性疾病；③心脏病、糖尿病、肝肾功能不全者等；④抑郁、狂躁、精神分裂等精神系统疾病患者；⑤临床信息缺失、不全者；⑥使用免疫抑制剂或增强剂患者。

1.2 研究方法

1.2.1 记录研究对象年龄、性别、病理分类、临床分期等一般指标。

1.2.2 样本的选取：收集手术切除的新鲜肺癌临床组织，根据组织与癌灶的位置关系，分为对照组织、癌交界组织(癌旁组织)和癌灶组织。其中对照组织是指远离癌组织5 cm以上的非癌组织部分；癌交界组织是指肉眼可见癌组织和正常组织交界部分；癌灶组织是指癌中心区到癌边缘部分剔除掉坏死组织的部分。上述组织均是在临床医生指导下手术获取的。

1.2.3 流式检测：单细胞悬液的制备：将上述新鲜组织用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)充分冲洗，剪成米粒大小颗粒后，移入2 ml Ⅳ型胶原酶(0.1%浓度，Sigma)的1640培养基消化液中，37 ℃恒温箱消化处理60 min，以含有10 ml 15%小牛血清的1640培养基终止消化；研磨处理并过滤筛选后(70 μm滤网)，将滤液离心洗涤2次(1800 r/min×5 min)；细胞经PBS悬重再次去除细胞团块后获得组织浸润的单细胞悬液，调整细胞浓度至1×108/ml用于后续检测。

将细胞置于1640 完全培养基(0.1% PMA+ 0.1% Iono Mycin)中37 ℃刺激培养60 min后加入Brefeldin A(1∶1000)，继续培养4 h后终止刺激。PBS充分洗涤离心后将1×108个细胞转移至96孔板中，分别加入anti-CD3，anti-CD4流式抗体，混匀后4 ℃反应25 min，加入红细胞裂解液100 ml，37 ℃下溶血10 min；PBS洗涤后以单标管建立多重流式检测补偿方案；依据该补偿方案，将混合抗体加入单细胞悬浮液中，混匀后4 ℃下反应25 min，加入红细胞裂解液100 ml，37 ℃下溶血10 min,PBS洗涤1次后，破膜打孔，加入对应标记的IgG同型对照胞内抗体，继续于4 ℃反应20 min；充分洗涤后，进行流式检测。

1.2.4 PD-L1的表达:将切取的组织标本置于10%福尔马林溶液中固定24 h，石蜡包埋。梯度乙醇浸泡、石蜡包埋、平面视网膜切片后，60 ℃烘烤25 min。脱蜡水化、蒸馏水浸泡后，苏木素染色2 min水洗。随后用盐酸(0.5%浓度)、酒精浸泡10 s，0.5%伊红溶液染色2 min。二甲苯溶液将其透明化后，中性树胶封片晾干。

PD-L1表达判读标准如下：肺部肿瘤组织细胞膜或细胞质出现棕色或黄色颗粒为PD-L1染色阳性，其中肿瘤细胞中着色细胞占细胞总数小于1%记为0分，1%～10%记为1分，10%～50%记为2分，50%～100%计为3分；肿瘤细胞无染色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色计为3分。两者相乘得分为PD-L1免疫组化结果：0分记阴性(-)，1～3分记弱阳性(+-)，4～6分记阳性(+)，7～9分记为强阳性(++)。阴阳性定义如下：0分为阴性、1分为弱阳性、2分为阳性、3分为强阳性。

2 结 果

2.1 患者一般临床资料 85例NSCLC患者中男49例，女36例；年龄≥60岁57例，<60岁28例；病理类型：腺癌56例，鳞癌29例；EGFR基因突变的有35例，未突变的有50例；临床分期：Ⅰ期40例，Ⅱ期16例，Ⅲ期20例，Ⅳ期9例；未发生淋巴结转移的有56例，发生转移的有29例；肿瘤分化：低分化22例，中分化54例，高分化9例。

2.2 NCSLC患者组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率比较 NCSLC患者对照组织、癌旁组织与癌灶组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率比较见表1。由表1可知，与对照组织相比，癌旁组织和癌灶组织的CD4+T细胞和CD8+T细胞比率均显著高于对照组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。NCSLC患者肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率较癌旁组织显著提高(P<0.05)。结果表明肿瘤组织中T淋巴细胞数量显著增加，这可能导致免疫细胞比例失衡，不能准确识别和清除癌细胞，致使机体出现免疫功能障碍。

表1 NCSLC患者组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率比较(%)

2.3 NCSLC患者肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率与临床参数的关系 NCSLC患者肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率与临床参数的关系见表2。由表2可知，NCSLC患者肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率与患者性别、年龄、病理类型以及肿瘤是否伴随EGFR基因突变及淋巴结转移均无关，差异无统计学意义(均P>0.05)，与患者的肿瘤病理分析情况联系紧密，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 NCSLC患者肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比率与临床参数的关系(%)

2.4 NCSLC患者组织中巨噬细胞比率比较 NCSLC患者对照组织、癌旁组织与癌灶组织中巨噬细胞比率比较见表3。由表3可知，与对照组织相比，癌旁组织和癌灶组织的巨噬细胞比率显著低于对照组织，巨噬细胞M2型比率显著高于对照组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。NCSLC患者肿瘤组织中巨噬细胞比率较癌旁组织进一步降低，巨噬细胞M2型比率较癌旁组织进一步升高，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明肿瘤组织中与促炎症因子释放及激活免疫应答相关的M1型巨噬细胞比率降低，而与抗炎症因子释放及抑制免疫应答相关的M2型巨噬细胞比率升高，提示随着肿瘤过程的进展，M2型巨噬细胞逐渐向肿瘤外扩散，诱导肿瘤细胞的生长和转移。

表3 NCSLC患者肿瘤组织中巨噬细胞比率比较(%)

2.5 NCSLC患者肿瘤组织中巨噬细胞比率与临床参数的关系 NCSLC患者肿瘤组织中巨噬细胞和M2型巨噬细胞比率与临床参数的关系见表4。由表4可知，NCSLC患者肿瘤组织中巨噬细胞核M2型巨噬细胞比率与患者性别、年龄、病理类型、病理分期以及肿瘤是否伴随EGFR基因突变及淋巴结转移均无关，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表4 NCSLC患者肿瘤组织中巨噬细胞比率与临床参数的关系(%)

2.6 PD-L1在不同NSCLC组织中的表达情况 见表5。与对照组相比，PD-L1在 NSCLC 患者癌旁组织和癌灶组织中阳性表达率均明显高于对照组织，差异具有统计学意义(P<0.05)；肿瘤组织中PD-L1阳性和强阳性表达较癌旁组织均显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明PD-L1可在一定条件下作为非小细胞肺癌检测的分子标记物。

表5 PD-L1在不同NSCLC组织中的表达情况(例)

3 讨 论

肺癌的发展不仅与肺癌细胞自身特性相关，亦与肿瘤细胞所处的免疫微环境密切相关[10-11]。T淋巴细胞在肺癌免疫微环境中发挥着杀伤癌细胞及免疫监视的作用，具有识别T细胞受体、分泌多种细胞因子调节免疫应答的重要功能，在肺癌的发生发展过程中起着重要作用。研究证实，肿瘤相关巨噬细胞及PD-L1蛋白的表达亦与NSCLC的进展息息相关[12-14]。

目前，关于免疫细胞及在NSCLC肿瘤局部的表达及其与临床病理关系的研究较少[15-16]。基于此，本研究选取了85例NSCLC患者为研究对象，采用流式细胞术检测患者对照组织、癌旁组织和癌灶组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、M2型巨噬细胞比率，并探讨其与临床病理特征的关系。流式细胞检测结果表明，NCSLC 患者癌旁组织和癌灶组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞比率、M2型巨噬细胞比率均显著高于对照组织(P<0.05)，巨噬细胞比率显著低于对照组织；与癌旁组织相比，NCSLC 患者肿瘤组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞比率、M2型巨噬细胞比率进一步升高，巨噬细胞比率进一步降低，差异具有统计学意义(均P<0.05)。说明随着肺癌进程的进展，肿瘤组织中T淋巴细胞数量和与抗炎症因子释放及抑制免疫应答相关的M2型巨噬细胞比率显著增加，而与促炎症因子释放及激活免疫应答相关的M1型巨噬细胞比率降低，这将导致免疫细胞比例失衡，致使机体出现免疫功能障碍；且随着肿瘤过程的进展，M2型巨噬细胞逐渐向肿瘤外扩散，诱导肿瘤细胞的生长和转移[17-19]。T细胞、巨噬细胞与临床病理特征的关系研究表明，NCSLC患者肿瘤组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞比率、吞噬细胞及M2型吞噬细胞比率与患者性别、年龄、病理类型以及肿瘤是否伴随EGFR基因突变及淋巴结转移均无关(P>0.05)；CD4+T细胞、CD8+T细胞比率与患者的肿瘤病理分期情况联系紧密，差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果表明，肿瘤组织中PD-L1阳性和强阳性表达较癌旁组织均显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。提示PD-L1可作为NCSLC有效诊断的分子标记物。

综上所述，本研究结果提示在NSCLC中CD4+T细胞、CD8+T细胞、M2型巨噬细胞比率较高，巨噬细胞比率较低，说明其共同参与机体抗肿瘤免疫应答，促进肿瘤的发生和发展，对于NSCLC的生长和转移具有重要意义；此外，PD-L1蛋白在NSCLC肿瘤组织中高表达，可将其作为NSCL患者诊断的分子标记物。即NSCLC 患者免疫微环境中多种免疫细胞参与肿瘤的生长，并促进肿瘤的转移。