安 敏，高振军

(复旦大学附属中山医院青浦分院消化科，上海 210007)

流行病学研究[1-2]显示，与正常人群相比较，溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)患者癌症的风险高出5.7倍，疾病诊断后10年、20年、30年结直肠癌累积发生率分别为1.6%、8.3%和18%。5-氨基水氧酸(5-Aminosalicylic acid，5-ASA)是治疗UC及维持轻中度UC患者缓解的常用药物，研究显示，5-ASA和磺胺嘧啶可显著降低UC患者大肠癌发生风险[3-4]。荟萃分析[5]显示，口服1.2 g/d ASA的UC患者大肠癌发生优势比为0.551，在更高剂量下可降低至0.23。虽然多项研究表明长期服用5-ASA具有抗肿瘤作用，但5-ASA对UC的治疗和化学预防机制仍不明确。在啮齿类大肠癌模型中，5-ASA可抑制肿瘤生长并减少异常隐窝病灶数量[6]。5-ASA已在几种不同的大肠癌(Colorectal cancer，CRC)细胞系中以时间和剂量依赖的方式显示生长抑制和凋亡诱导作用。在文献报道的由氨基水杨酸调节的靶点中，目前研究较多的包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、核因子-κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)、Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)途径以及环氧化酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)，但5-ASA调节肿瘤进展的确切分子靶点和途径尚未完全明确[7-8]。缺乏β-catenin或COX-2或具有突变形式的CRC细胞系也会对5-ASA的暴露产生反应，表现为细胞周期停滞或凋亡或肿瘤形成能力下降，提示在5-ASA的作用机制中涉及替代途径，并且5-ASA的抗炎作用与细胞培养模型中的抗癌作用一致[9-10]。在早期的一项研究中，5-ASA在LS180结肠癌细胞系中抑制了TC22和一种与CRC相关的新型原肌球蛋白亚型[11]。因此，5-ASA的潜在抗癌作用部分归因于与阿司匹林的结构相似，并可能由PPARγ和NF-κB p65介导。本研究选择既往文献报道中与致癌和炎症相关的基因进行观察，旨在了解长期使用美沙拉嗪后结肠组织的分子变化为临床相关浓度下5-ASA的化学预防作用提供临床数据支持，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集在青浦区中山医院青浦分院接受长期美沙拉秦治疗的61例UC患者作为研究对象，病例纳入标准：①患者年龄18～65岁，性别不限；②持续性或反复发作性黏液血便、腹痛伴有不同程度全身症状，联合肠镜和(或)黏膜活检确诊为UC，病情严重程度轻、中度；③持续服用美沙拉秦≥2年；对研究知情并签署知情同意书。排除标准：重度UC；采用≥20 mg以上类固醇激素治疗者；合并严重心、肝、肾功能不全者；既往有胃肠道手术史者；合并恶性肿瘤患者；孕期或哺乳期妇女；精神疾病或严重认知功能障碍者；拟纳入或已纳入其他临床研究者。共纳入患者61例，其中男39例，女22例；年龄23～61岁，平均(41.83±11.566)岁；病程3～12年，平均(5.38±2.46)年；病变范围：全结肠炎37例，左侧结肠炎25例。

1.2 研究方法 患者每天服用1.5～3.0 g美沙拉秦(批号：080328)维持治疗，药物剂量由临床医师根据病情判定。治疗前和治疗2年时给予结肠镜检查，活检标本取自直肠、乙状结肠，标本分为两份，一份用福尔马林固定进行病理分级 ，另一份-80 ℃快速冷冻用于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR),分析。基线和2年时评估患者的Mayo活动指数(Mayo AI)，Mayo AI包括大便频数、血便、医师评分和黏膜表现等4个条目，每个条目以4级法进行评分，分别得分0～3分，其中黏膜表现参照内窥镜检查结果：0分表示正常和静止性炎症，1分表示轻度炎症，2分表示中度炎症，3分表示严重炎症，可伴自发性出血、溃疡等表现。组织病理学评分根据Nancy组织病理学评分进行病理分级，分为0～3分，分别代表无活动性炎症、轻度活动性炎症、中度活动性炎症和重度活动性炎症。随访时Mayo AI≤1分定义为显效，Mayo AI或组织病理学评分降低≥1分定义为有效，否则定义为无效，显效加有效定义为治疗有效。

1.3 RT-PCR检测 用罗氏Lightcycler和Qiagen SYBR绿色PCR试剂盒进行实时RT-PCR。所有样品在95 ℃下变性45 s，然后在62 ℃和72 ℃下分别进行30个扩增周期，每次10 s和12 s。以β-actin为内对照，用检测引物对两份样品进行检测。通过使用2-ΔΔCt方法将测试样品的阈值(Ct)与肌动蛋白(β-actin，内部对照)的Ct值标准化。基因引物见表1。治疗前后基因变化率=(治疗后基因相对表达量-治疗前基因相对表达量)/治疗前基因相对表达量×100%。

表1 相关基因引物序列

2 结 果

2.1 患者临床特征和美沙拉秦治疗后病情变化 61例患者随访时病情缓解(Mayo AI≤1分)30例，活动期UC(Mayo AI>1分)31例；服用美沙拉嗪1.5 g/d者34例，3.0 g/d者27例，1.5 g/d和3.0 g/d美沙拉秦患者临床疗效均无统计学差异(82.35%与77.78%,χ2=0.199，P=0.655)；根据Mayo AI评分有49/61例(80.33%)患者被归于治疗有效。根据组织病理学检查，38/61例(62.30%)患者的组织病理学有所改善，17/61例患者保持不变，6/61例(9.84%)出现组织病理学恶化(炎症程度增加)。

2.2 患者治疗前后结肠黏膜相关基因表达水平比较 治疗后患者细胞增殖核抗原(Ki-667)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、BCL2L1、P53、CXC趋化因子配体10(CXCL10)、PPAR-γ、NF-κB mRNA相对表达水平均较治疗前显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；治疗后患者细胞分裂周期因子25A(CDC25A)、CTNNB1、COX-2、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平均低于治疗前，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 患者治疗前后结肠黏膜癌相关基因表达水平比较

续表

2.3 患者治疗前后Mayo AI评分和Nancy组织病理评分比较 治疗后患者Mayo AI评分和Nancy组织病理评分均较治疗前显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 患者治疗前后Mayo AI评分和Nancy组织病理评分比较(分)

2.4 变量与美沙拉秦用药时间的多元线性回归结果 以治疗前后变量为应变量，将性别、年龄、病变部位、病程、治疗前Mayo AI评分、Nancy组织病理评分、美沙拉秦剂量、美沙拉秦治疗时间等变量引入多元线性回归，结果显示，药物应用时间与Ki-67、NF-κB、PPAR-γ、COX-2、IL-8、CXCL10、CDC25A基因变化率显著相关(P<0.05)。见表4。

表4 变量与美沙拉秦用药时间的多元线性回归结果

3 讨 论

临床研究表明柳氮磺胺吡啶和5-ASA对UC具有抗癌作用，但这些作用的分子机制尚未完全阐明。本研究的目的是测量长期5-ASA治疗对UC患者结肠活检组织中致癌相关基因表达的影响，从而为5-ASA的化学预防作用提供分子基础。既往研究[12]显示，NF-κB(p65)、PPAR-γ、COX-2、CXCL10、TNF-α、IL-8、CDC25A、p53等基因参与介导5-ASA对结直肠细胞的生长抑制、促凋亡、抗氧化、抗菌和抗炎作用。其他靶基因，如增殖标记物Ki-67也被用作癌症的预后标记物[13]。BCL2L1是一种重要的凋亡调节基因，编码抗凋亡的Bcl-xL和促凋亡的Bcl-xS剪接变体、CEACAM-1也是与结肠癌相关的基因[14]。本研究观察了癌症及炎症相关基因与5-ASA长期治疗的相关性。

本研究结果显示，结肠活检组织中COX-2、CDC25A、CXCL10、IL8、NF-κB和Ki-67转录水平变化与5-ASA治疗持续时间相关。这些抗炎和细胞周期调控基因降低可通过5-ASA的抗癌作用和降低疾病活动进行解释，5-ASA的抗炎作用与抗癌作用可能存在重叠。既往研究[15-17]证实，UC的严重程度与炎症程度呈正相关，与结肠炎相关的发育不良和结直肠癌密切相关。但有研究[18]显示，一些已知参与癌变过程的基因(PPARγ、CEACAM、β-catenin和P53)的表达减少与患者UC疾病活动性无关。此外，COX-2、IL-8和TNF被认为是炎症的重要标志物，与炎症的临床表现(Mayo AI和组织学)相关，而与炎症和癌变相关的Ki-67、NF-κB和CXCL10仅与内窥镜表现相关。这可能提示5-ASA即使在没有明显改善溃疡性结肠炎活动情况下也具有癌症化学预防作用。考虑到本研究中获得的活检样本是包括上皮细胞、间充质细胞和炎性细胞的细胞群，仅根据基因表达的变化难以详细区分5-ASA抗炎和抗癌效果，未来研究中评估这些基因在5-ASA治疗患者活检组织中的原位表达或蛋白水平，将为5-ASA分子靶点的作用提供更多的证据。

在结直肠癌细胞系和小鼠UC模型中，5-ASA暴露产生的抗炎和抗肿瘤作用伴随着PPARγ水平的升高，在某些情况下，COX-2表达同时降低。据报道，与健康志愿者相比，UC患者的PPARγ水平显著降低，并且局部使用罗格列酮(一种PPARγ激动剂)治疗的活动期UC患者的Mayo内窥镜评分降低程度与5-ASA相似[19]。然而，在本研究中，PPARγ的转录水平与疾病活动性或疾病持续时间无关。然而，COX-2的表达与5-ASA暴露时间显著相关。细胞学研究[20]显示，每隔24 h反复暴露于2 mM 5-ASA可持续抑制与炎症、细胞周期检查点调节和凋亡有关的基因靶点(Ki-67、CXCL10、IL-8、BCL2L1、CASP8和CDC25A)。这些观察结果表明，长期坚持美沙拉秦方案是获得最大疗效必要条件。

这些结果表明，美沙拉秦长期治疗可调控与癌变相关的多个基因，为UC患者长期使用美沙拉秦作为结直肠癌化学预防提供了依据。