杜苏丰，孙万里，郭新成

(1.西安市胸科医院结核内科，陕西 西安 710100；2.西安市胸科医院重症医学科，陕西 西安 710100；3.汉中市中心医院重症医学科，陕西 汉中 723000)

呼吸机相关性肺炎(Ventilator associated pneumonia，VAP)是一种严重的医院获得性肺炎，为患者机械通气治疗中常见的并发症。其发病主要与机械通气或外源性气管插管有关[1-2]。危重症患者常有多种侵入性操作史，机体长期处于应激状态，引起代谢异常、机体营养水平低下、免疫水平降低，使感染发生几率大大增加[3]。机械通气易引起患者发生VAP，其发病率高、病死率高[4]，严重影响患者的身心健康。

随着抗生素的广泛使用，肠杆菌、铜绿假单胞菌以及鲍曼不动杆菌等病原菌的耐药性日益严重[5]。肠杆菌是目前VAP中最常见的病原菌之一，其耐药机制主要与产生超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum beta-Lactamase,ESBLs)有关，对产ESBLs 肠杆菌所致的各类感染疾病为亟待解决的问题[6]。自然杀伤(Natural killers，NK)细胞是一种淋巴细胞，为机体免疫系统第一道防线，能发挥重要的细胞毒性效应快速消灭靶细胞，有研究表明，NK细胞数量对肺炎的预后有重要指导意义[7]。T细胞亚群是极为重要的参与细胞免疫的细胞群，以 CD4+、CD8+为代表，多种感染性和免疫性疾病常以二者比值对细胞免疫状态进行评估[8]。本研究通过对ESBLs-VAP患者NK细胞和T细胞亚群动态变化进行检测分析，并对引起ESBLs-VAP的危险因素进行研究，以期为临床提供一定依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以90例2016年2月至2020年3月收入的重症肺炎行机械通气发生VAP患者为研究对象，以感染ESBLs肠杆菌 VAP患者为研究组，共28例，以未感染ESBLs肠杆菌 VAP患者为对照组，共62例。患者一般资料如表1所示，两组患者年龄、性别、发生VAP时间、通气时间及住院时间等一般资料经比较分析差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。患者及家属均充分了解研究内容并签署知情同意书，本研究已获得医院伦理委员会的准许。病例纳入标准：①符合《呼吸机相关性肺炎诊断、预防和治疗指南》中关于VAP的诊断标准；②患者使用呼吸机通气48 h后所发生的肺炎；③胸部 X 影像学检查显示可见新发生的或表现为进展性的浸润阴影；④气管和支气管内有脓性分泌物出现；患者体温>38.0 ℃或<36.0 ℃；患者外周血白细胞>10.0×109/L 或<4.0×109/L。排除标准：①资料不完全者；②机械通气时间未达到48 h；③机械通气<48 h前痰培养检查显示有病原菌者；④无法自主呼吸，需使用呼吸机维持生命者；⑤气管插管后短期死亡者；⑥有应用大剂量糖皮质激素、免疫抑制剂或免疫增强剂史者。

表1 两组患者一般资料比较

1.2 研究方法

1.2.1 T淋巴细胞亚群检测：所有患者均于入住ICU时、机械通气48 h及第7天抽取肘静脉血3 ml，置于EDTA抗凝管中。于实验管中分别加入20 μl鼠抗人特异性单克隆抗体(PerCP-CD3、PE-CD8及FITC-CD4)，再加入100 μl静脉血，在漩涡混匀器上进行混匀，在4 ℃避光条件下孵育30 min。再加入溶血素2 ml，混匀室温下避光8 min以使红细胞充分裂解，离心分离(1500 r/min,5 min)，弃去上清液，加入PBS液1 ml进行洗涤，以多聚甲醛液固定。使用流式细胞仪测定样本中CD4+T以及CD8+T淋巴细胞在CD3+T淋巴细胞中的比例。

1.2.2 NK细胞检测：所有患者均于入住ICU时、机械通气48 h及第7天抽取肘静脉血3 ml，置于EDTA抗凝管中。于实验管中加入20 μl鼠抗人特异性单抗(FITC-CD3和PE-CD56+CD16)，再加入100 μl新鲜静脉血，在漩涡混匀器上进行混匀，在4 ℃避光条件下孵育30 min。再加入溶血素2 ml，混匀，室温下避光8 min以使红细胞充分裂解，离心分离(1500 r/min,5min)，弃去上清液，加入PBS液1 ml进行洗涤，以多聚甲醛液固定，4 ℃固定30 min。使用流式细胞仪测定样本中NK 细胞在淋巴细胞中占比。

1.2.3 危险因素分析：对所有患者一般情况、实验室检查、治疗情况等进行统计分析。一般情况包括性别、年龄、住院时间、基础疾病(糖尿病、冠心病、肺部基本疾病以及恶性肿瘤等)等。实验室检查包括患者白蛋白水平、痰培养、药敏试验等。治疗情况包括抗生素使用情况(种类和时间)、患者机械通气时间、患者意识情况等。

2 结 果

2.1 两组患者不同时间NK细胞比例比较 与对照组相比，研究组患者NK细胞比例在干预前差异无统计学意义(P>0.05)，在第2天和第7天均显著降低(P<0.05)；相比于干预前的基线值，第2天时两组NK细胞比例均显著降低(P<0.05)，第7天时两组NK细胞比例显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者不同时间NK细胞比例比较(%)

2.2 两组患者不同时间T细胞亚群比较 与对照组相比，研究组患者CD4+T细胞比例在干预前、第2天和第7天差异无统计学意义(均P>0.05)，CD8+T细胞占比在干预前和第2天差异无统计学意义(均P>0.05)，第7天时显著升高(P<0.05)；相比于干预前基线值，两组患者CD4+T细胞占比在第2天和第7天均无明显波动(P>0.05)，两组患者CD8+T细胞占比在第2天无明显波动(P>0.05)，研究组在CD8+T细胞占比第7天时升高显著(P<0.05)。见表3。

表3 两组患者不同时间T细胞亚群比较(%)

2.3 ESBLs-VAP 危险因素的单因素分析 患者性别、年龄和糖尿病不会使ESBLs-VAP风险增加(均P>0.05)；但患有肺部基础疾病、白蛋白水平、患者意识障碍、机械通气时间>5 d、应激性高血糖、抗生素>2种、抗生素天数在两组比较中差异有统计学意义(均P<0.05)，是引起ESBLs-VAP的危险因素。见表4。

表4 两组ESBLs-VAP单因素分析

2.4 ESBLs-VAP 危险因素的多因素分析 根据单因素分析结果，对肺部基础疾病、白蛋白水平、患者意识障碍、机械通气时间>5 d、应激性高血糖、抗生素>2种、抗生素天数这几种因素进行Logistic回归分析，结果见表5所示。表明肺部基础疾病、白蛋白水平、患者意识障碍、机械通气时间>5 d、应激性高血糖、抗生素>2种可作为ESBLs-VAP的独立危险因素。

表5 ESBLs-VAP多因素回归分析

3 讨 论

随着临床上抗生素的广泛使用，致病菌对抗β-内酰胺类菌药物的耐药性日益加重，特别是ESBLs细菌的产生，给临床治疗带来很大的挑战。ESBLs主要由大肠杆菌以及肺炎克雷伯菌产生，亦可由沙门菌属、柠檬酸杆菌属等细菌产生[9-11]。产ESBLs肠杆菌均能发生垂直传播，同时ESBLs肠杆菌中的酶还能通过质粒传播给同科其他细菌，极容易导致交叉感染及耐药菌扩散，因此有必要对ESBLs菌所致VAP的机制进行研究[12-13]。

本研究对ESBLs-VAP患者外周血中NK细胞在淋巴细胞中的占比进行研究分析，结果显示，与对照组相比，研究组患者NK细胞比例在干预前差异无统计学意义(P>0.05)，在第2天和第7天均显著降低(P<0.05)；相比于干预前的基线值，第2天时两组NK细胞比例均显著降低(P<0.05)，第7天时两组NK细胞比例显著升高(P<0.05)。NK细胞是人体免疫系统第一道防线，参与了机体适应性免疫和固有免疫反应，能在感染初期发挥重要的细胞毒效应消灭靶细胞NK 细胞，也对不成熟的树突状细胞有杀伤作用，也可通过分泌 IFN-γ和TNF-α以促进树突状细胞的成熟，再依靠与树突状细胞的交互作用使其向T细胞的抗原递呈效应增强，严重感染可引起外周血中NK细胞明显减低[14]。

本研究对两组CD4+T和CD8+T细胞占CD3+T细胞比例进行检测分析，结果表明，与对照组相比，研究组患者CD4+T细胞比例在干预前、第2天和第7天均差异无统计学意义(P>0.05)，CD8+T细胞占比在干预前和第2天差异无统计学意义(P>0.05)，第7天时显著升高(P<0.05)；相比于干预前基线值，两组患者CD4+T细胞占比在第2天和第7天均无明显波动(P>0.05)，两组患者CD8+T细胞占比在第2天无明显波动(P>0.05)，研究组在CD8+T细胞占比第7天时升高显著(P<0.05)。T细胞亚群以CD3+为代表，是重要的免疫细胞类群，参与机体细胞免疫；辅助/诱导T细胞以CD4+为代表，抑制/细胞毒性T细胞以CD8+为代表，常用二者对免疫和感染性疾病的细胞免疫状态进行评估[8]。危重症患者术后存在创伤应激状态，患者免疫功能紊乱，出现免疫力下降，免疫应答减弱，表现为CD4+T减少，CD8+T增加，进而引起使免疫失衡，导致严重感染发生[15]。

本研究采用单因素分析对可能引起ESBLs-VAP的危险因素进行研究，结果显示患者性别、年龄和糖尿病不会使ESBLs-VAP风险增加(P>0.05)；但患有肺部基础疾病、白蛋白水平、患者意识障碍、机械通气时间>5 d、应激性高血糖、抗生素>2种、抗生素天数在两组比较中差异有统计学意义(P<0.05)，是引起ESBLs-VAP的危险因素。根据单因素分析结果，对上述几种因素进行Logistic 回归分析，结果表明肺部基础疾病、白蛋白水平、患者意识障碍、机械通气时间>5 d、应激性高血糖、抗生素>2种可作为ESBLs-VAP的独立危险因素。患者存在的慢性肺部基础疾病易引起肺部结构和功能的改变，且因长期使用抗生素等，免疫力低下，感染率增加。血清白蛋白降低表示患者营养状况较差，对呼吸系统肌肉功能有一定损害，增加呼吸衰竭及感染风险[16]。存在意识障碍的患者多有活动受限，自主呛咳反应弱，易使口咽部及胃内容物发生误吸入肺内，使ESBLs-VAP发生率明显升高[17]。机械通气会损伤呼吸道正常的防御功能，降低其细菌清除功能，易诱发肺部感染。应激性高血糖使血液处于高渗状态，引起血管通透性的改变，影响中性粒细胞的趋化、吞噬能力，增加ESBLs-VAP风险[18]。使用2种以上的抗生素易引起肠源性的感染，使肠道菌群失调，损伤肠道的屏障功能，使耐药菌从多种途径进入呼吸道发生肺部感染[19]。

综上所述，ESBLs-VAP的发生与NK细胞、T细胞亚群的改变有关，肺部基础疾病、白蛋白水平等因素是其独立预测因素。