秦怀远，李和刚，张 宁，辛京京，赵金山

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）源于Ⅱ型微生物适应免疫系统，在该系统中细菌会通过入侵噬菌体和质粒来破坏基因组信息保护自己[1]。当病毒侵入个体，会释放出病毒DNA，当细菌检测到病毒DNA 存在时会释放出2 种RNA，其中sgRNA 与病毒DNA 相结合配对，另一种RNA 指导合成Cas9 蛋白并与sgRNA 组成复合物，从而切断病毒DNA 使其失效[2-3]。CRISPR/Cas9 系统需要通过识别在Cas9 靶位点上的一个原间隔子相邻基序（PAM）[4-6]序列进行特异性靶向基因编辑。目前广泛使用的化脓性链球菌SpCas9 识别的PAM 为NGG（N为任意碱基，G 为鸟嘌呤），也就是说它仅仅能识别靶向基因组中1/16 的位点[7]，所以NGG 的PAM 并不能满足对广谱基因的编辑需求，因此研究者们试图通过降低PAM 对CRISPR/Cas9 使用的限制，来拓宽CRISPR/Cas9 系统的编辑范围。

Kleinstiver 等[8]在野生型SpCas9 的基础上，进行R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R 7 个位点的定点突变，成功构建出了PAM 仅为NG的Cas9 突变体SpCas9-NG。Hu 等[9]运用噬菌体辅助持续演化（Phage-Assisted Continuous Evolution，PACE）[10]的方法来进化并拓展其识别的PAM 序列获得了xCas9。xCas9 比SpCas9 有更高的DNA 靶向特异性，而且将PAM 的限制也降至了NG。Liu[11]团队证实xCas9 在兔子中具有扩展PAM 兼容性和增强的碱基编辑效率，可用于生物体中的精确基因修饰。而Chatterjee 等[12]发现一种SpCas9 的直系同源物，来自犬链球菌的ScCas9，其与SpCas9 具有89.2%的同源性，在CRISPR/Cas9 晶体REC3 结构域[13-14]中，于367 至376 位插入了10 个带正电荷的氨基酸（IKHRKRTTKL），并且在1 337 和1 338 位置上插入了另外2 个氨基酸（KQ）[15]，最后PAM 进一步放宽至NNGN，而且也有较强的靶向切割活性。这些发现进一步拓展了CRISPR 系统的靶向范围。

虽然上述研究已经将CRISPR/Cas9 的PAM 限制降低至NG（SpCas9-NG、xCas9 等）以及NNG（ScCas9 等），但是想要更加彻底地使用CRISPR/Cas9 进行全基因组的无限制基因编辑，就必须进一步降低PAM 的限制。……