王冬萍，王萌，任晓亮

（1.天津中医药大学中医药研究院，教育部工程研究中心，天津 301617；2.天津中医药大学中药学院，天津 301617）

异绿原酸A，又称3，5-二咖啡酰奎宁酸，属于咖啡酰奎宁酸类。异绿原酸A不仅存在于菊科、忍冬科、豆科等药食两用植物中[1]，在水果（如杏、李子）和蔬菜（胡萝卜）等食品中也大量存在[2-3]。作为功能性天然产物，异绿原酸A的研究已深入到食品、医药和保健等多个领域。绿原酸类物质为众多中药材（如金银花、茵陈蒿、杜仲）以及中成药（如复肝宁、双花注射液、粉刺口服液、银黄颗粒）的主要药效成分[4]，2015版《中华人民共和国药典》规定异绿原酸A为银黄颗粒的指标性成分[5]。现代药理研究表明，异绿原酸A具有较强的抑菌、抗炎、抗氧化、降血压等作用[6-8]，并能有效抑制人体免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的复制[9]。异绿原酸A属于酚类化合物，该类物质的酯键、不饱和双键在水溶液中可能发生水解，酚羟基易发生氧化降解[10-11]，但目前尚无系统的有关异绿原酸A稳定性研究的报道。因此本实验依照《人用药物技术要求国际协调理事会》（ICH）和《国家药品监督管理局》（NMPA）对药物稳定性的指导原则，采用化学反应动力学方法系统研究了异绿原酸A在多种物理、化学环境下的降解规律，预期为含有异绿原酸A的药物制剂在开发、生产、贮藏及合理应用上提供参考。

1 材料

1.1 试剂和药品 异绿原酸A对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号B21539，纯度≥98%）；乙腈、甲醇[色谱纯，赛默飞世尔（中国）科技有限公司]；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；盐酸（分析纯，天津化学试剂一厂）；甲酸（色谱纯，美国ROE SCIENTIFIC INC）；氯化铁、氯化亚铁（分析纯，阿拉丁试剂上海有限公司）；氢氧化钠、氯化钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；3% H2O2（分析纯，河北吉捷生物科技有限公司）。

1.2 仪器 Acquity H-class超高效液相色谱（美国Waters公司）；SB-3200D数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；AX224ZH十万分之一天平（奥豪斯仪器有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（常州金坛良友仪器有限公司）；DELTA 320 pH仪（瑞士Mettler Toledo公司）。

2 方法与结果

2.1 超高液相色谱（UPLC）色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱；流速0.2 mL/min；柱温30℃；检测波长212 nm；梯度洗脱0～6 min：10%～40%乙腈。

2.2 对照品及样品溶液制备 精密称取异绿原酸A对照品5.12 mg，置于5 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为1.024 mg/mL的对照品储备液。精密吸取上述储备液200 μL置于10 mL棕色容量瓶中，用纯水及各稳定性研究介质溶液定容至刻度，摇匀，得到浓度为20.48 μg/mL的对照品溶液和稳定性试验用样品溶液。

2.3 异绿原酸A稳定性研究

2.3.1 酸碱性对异绿原酸A稳定性的研究 绿原酸和异绿原酸A分属于单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸，生物合成途径相似，常常共存在植物体内[10]。绿原酸由一分子咖啡酸和一分子奎宁酸缩合而成，分子结构中有酯键、不饱和双键及二元酚3种不稳定基团，碱性条件下酯键极不稳定，容易水解[11]。为了考察酸碱性对异绿原酸A稳定性的影响，采用氢氧化钠和盐酸溶液配制成不同pH值溶液（pH 3.0、5.0、6.2、8.0、10.0），用多点校正过的 pH 计测定其pH值。采用“2.2”项下样品配制方法，取异绿原酸A储备液200 μL置于10 mL棕色容量瓶中，分别采用以上不同pH水溶液定容至刻度，精密制得质量浓度为20.48 μg/mL的样品溶液，密封后置80℃水浴中。间隔一定时间取样，UPLC测定异绿原酸A在不同pH值中的含量变化，得到不同pH值下异绿原酸A的降解动力学曲线并计算降解速率常数k。异绿原酸A对照品及碱性样品色谱图见图1。

图1 异绿原酸A对照品（A）及碱性样品（B）UPLC色谱图

以Ln（Ct/C0）为纵坐标，时间为横坐标作图，得到在不同pH值条件下异绿原酸A的降解动力学曲线，见图2。由实验结果可得异绿原酸A在不同pH值下的降解均符合一级反应过程，且在所有试验条件下的动力学曲线的相关系数均大于0.98。

图2 80℃不同pH值条件下异绿原酸A在水溶液中的降解动力学曲线

以不同pH值和其所对应的Ln（K）作图，得到pH值与异绿原酸A降解速率的关系图，见图3。异绿原酸A在酸性条件下较稳定；在碱性条件，特别是强碱条件下易降解。在pH 3～10下，随着pH的增大，降解速率加快，pH 10和pH 3水溶液中异绿原酸A的降解速率常数分别为0.546 4、0.010 8，pH 10条件下的降解速率常数为pH 3条件下的52倍，表明异绿原酸A在碱性水溶液中的水解过程可能由氢氧根离子催化发生。

图3 异绿原酸A降解速率与pH值的关系图

表1 异绿原酸A在不同pH条件下的降解速率常数k及半衰期t1/2

2.3.2 温度对稳定性的影响 多酚绿原酸类物质由于其结构中的多个酚羟基，高温加热情况下容易分解[11]。一般来说，温度升高时大部分化学反应的速率会升高。研究证明，温度每升高10℃，化学反应速率会增加2～4倍[12]。为了考察温度对异绿原酸A稳定性的影响，采用“2.2”项下样品配制方法，取异绿原酸A储备液200 μL置于10 mL棕色容量瓶中，用纯水定容至刻度，精密制得质量浓度为20.48 μg/mL的样品溶液，密封后分别置于 37、60、80℃水浴中。间隔一定时间取样，UPLC测定异绿原酸A在不同温度下的含量变化，得到异绿原酸A在不同温度下的降解动力学曲线并计算降解速率常数k。以Ln（K）为纵坐标，1/T为横坐标作图，得到温度对异绿原酸A降解速率的影响，见图4。可得异绿原酸A随温度升高，降解速率明显加快。通过阿仑尼乌斯方程Ln（K）=LnA-Ea/RT计算异绿原酸A降解反应的活化能，式中A表示异绿原酸A水解反应的指前因子，Ea表示活化能（J/mol），R表示摩尔气体常数（8.314 J/K/mol），T表示绝对温度（K）。计算得出异绿原酸A在25℃，中性条件下降解速率常数k为 0.000 5，降解半衰期（t1/2）为 1 381.9 h，活化能（Ea）为 96.71 kJ/mol。

图4 不同温度下异绿原酸A的降解速率常数k

2.3.3 金属离子对稳定性的影响 按照药典规定，绿原酸是评价金银花质量的主要标准[5]。大量研究发现当金银花保存在铁容器中时，绿原酸的含量会明显下降[13]。本研究采用不同价态的金属离子（Fe3+、Fe2+、Na+）考察其对异绿原酸A降解速率的影响。采用“2.2”项下样品配制方法，取异绿原酸A储备液200μL置于10mL棕色容量瓶中，分别用含有0.1mol/L FeCl3、FeCl2、NaCl的水溶液定容至刻度，精密制得质量浓度为20.48 μg/mL的样品溶液，密封后置于80℃水浴中。间隔一定时间取样，UPLC测定异绿原酸A在不同价态金属离子条件下的含量变化，得到异绿原酸A在不同价态金属离子中的降解动力学曲线。结果见图5，异绿原酸A在水溶液和加入0.1 mol/L Fe3+、Fe2+和 Na+的溶液中的 t1/2分别为3.458 h、0.020 h、0.295 h、3.185 h。结果证明 Fe3+对异绿原酸A的降解速率影响明显，Fe2+次之，而Na+对异绿原酸A降解速率无明显影响。

图5 异绿原酸A受不同金属离子的降解动力学曲线

2.3.4 初始药物浓度对稳定性的影响 采用“2.2”项下样品配制方法，分别取异绿原酸A储备液100、200、400 μL分别置于10 mL棕色容量瓶中，用纯水定容至刻度，精密制得质量浓度分别为10.24、20.48、40.96 μg/mL的样品溶液，密封后置于60℃水浴中。间隔一定时间取样，UPLC测定异绿原酸A含量变化，得到异绿原酸A在不同初始浓度的降解速率常数。以降解速率常数对各样品质量浓度作图，结果见图6。可知异绿原酸A的初始药物浓度增大，其降解速率无明显变化，说明初始药物浓度对异绿原酸A的降解速率无影响。

图6 不同初始药物浓度下异绿原酸A的降解速率

2.3.5 光照对稳定性的影响 光照在中药储存、晾晒、过程中不可避免，同时也易造成药材发生氧化、分解等化学反应[14]。绿原酸类物质分子结构中含有的酯键、不饱和双键及多元酚是其光不稳定的主要原因[15-17]。采用“2.2”项下样品配制方法，取异绿原酸A储备液200 μL置于10 mL棕色容量瓶中，用纯水定容至刻度，精密制得质量浓度为20.48 μg/mL的样品溶液，密封后分别于日光灯（1.55×106lux）、紫外灯（4.16×105lux）及避光条件下放置。间隔一定时间取样，UPLC测定异绿原酸A在不同光照条件下的含量变化。在光源一定时，药物在光照射下的含量下降的程度与入射光的强度E和时间t的乘积Et（累计光量）有关[12]。计算异绿原酸A在两种不同光照条件下的累计光量，得到异绿原酸A累计光量与含量的关系图。从图7可知，异绿原酸A的降解速率为紫外灯＞日光灯，表明紫外光对异绿原酸A的降解速率影响更大。因此，异绿原酸A及含该成分的相关药物在杀菌过程中应避免使用紫外线杀菌，防止其发生光化学反应。

图7 异绿原酸A在不同光照条件下累计光量与含量关系图

2.3.6 氧化对稳定性的影响 多酚类物质以其良好的抗氧化活性成为科学研究的一个热点[18]。绿原酸是重要的膳食抗氧化成分，其能够提供氢原子给自由基，抑制氧化损伤的发生。提供氢原子后，绿原酸被氧化成苯氧基自由基，苯氧基自由基进一步通过共振而达到稳态[19]。为了考察氧化对异绿原酸A稳定性的影响，采用“2.2”项下样品配制方法，用3% H2O2精密制得20.48 μg/mL的异绿原酸A水溶液，保持温度25℃。间隔一定时间取样，UPLC测定异绿原酸A的含量变化，得到异绿原酸A在氧化条件下的降解动力学曲线。由图8可知，加入3% H2O2的样品溶液与水溶液相比，降解速率常数变化不明显，说明异绿原酸A的稳定性受H2O2的影响较小。

图8 氧化条件下异绿原酸A的降解动力学曲线

3 讨论

研究表明异绿原酸A在多种物理、化学环境中均不稳定，且在各条件下的水解作用均遵循（伪）一级动力学过程。异绿原酸A的降解过程呈现明显的pH及温度依赖性，在酸性环境中异绿原酸A的稳定性较好，溶液碱性增强及温度升高均会使降解反应速度加快；而初始药物浓度及氧化对降解速率的影响不明显；金属离子Fe3+、Fe2+的引入以及紫外光均会使异绿原酸A的降解反应速率加快。异绿原酸A的活化能为96.71 kJ/mol，表明异绿原酸A在中性水溶液中的降解反应对于温度较为敏感，降解反应随着温度升高而大大加快。因此，异绿原酸A及含有该成分的相关药物应在低温条件下保存，在开发、生产及使用含有异绿原酸A药物时应使用弱酸性的条件，并控制容器及溶剂中存在的铁离子，避免与紫外光接触，防止其降解。在碱性条件下发现异绿原酸A产生两种降解产物，但目前暂无对异绿原酸A降解产物的研究。异绿原酸A属于二咖啡酰奎尼酸，为两分子咖啡酸和一分子奎宁酸结合而成的酯类化合物[10，20]。从异绿原酸A结构组成出发，推测其两种降解产物可能为咖啡酸和奎宁酸。本实验研究了异绿原酸A在不同条件下的降解规律，具体降解产物的研究会在后续进行。本研究从化学动力学的角度，探究了异绿原酸A在不同环境中的降解规律，为异绿原酸A及含有该成分的药物制剂的合理使用提供了依据。