袁青领，樊玉霞，刘 洋，王晓明，刘 征，贾 勐，耿祖仕，郑 建，卢秀波

郑州大学第一附属医院甲状腺外科 郑州 450052

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常见的人类甲状腺恶性肿瘤之一，目前全球发病率逐渐升高；PTC占所有甲状腺恶性肿瘤的60%～80%[1]。MicroRNA(miRNA)是长约22个核苷酸的小分子非编码单链RNA，可与其下游靶基因的3’非翻译区(3’UTR)相结合，参与细胞的增殖、凋亡及分化等生物学过程[2-3]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase, AKT)在细胞生理过程的各个阶段发挥重要作用，可磷酸化丝氨酸/苏氨酸[4]。AKT3是其亚型之一，其高表达可引起细胞恶性转化，参与甲状腺癌的进展过程[5]。

我们使用生物信息学软件预测miR-637与AKT3基因之间存在靶向关系并应用双荧光素酶报告实验进行了验证，然后观察转染miR-637的PTC细胞TPC-1中AKT3蛋白表达的变化以及细胞迁移及侵袭能力的改变，以期从分子水平阐明miR-637对PTC的影响。

1 材料与方法

1.1细胞、主要试剂及仪器DMEM、胎牛血清(美国 Hyclone公司)；二甲基亚砜、Transwell试剂盒(美国Sigma公司)；TPC-1细胞株(中国科学院细胞库)；miR-637 mimic、miR-637阴性对照(NC)购自上海吉凯基因公司；LipofectamineTM2000、质粒提取试剂盒、双荧光素酶报告实验试剂盒(美国Invitrogen公司)；CCK-8(碧云天公司)；兔抗人AKT3、β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Abcam公司)；荧光素酶活性检测仪(德国Berthold公司)。

1.2miR-637与AKT3基因靶向关系的预测及验证运用TargetScan对miR-637可能的靶基因进行预测。然后，应用双荧光素酶报告实验对预测结果进行验证。由上海吉凯基因公司设计并合成AKT3的野生型(AKT3-WT)和突变型(AKT3-MUT)3’UTR双荧光素酶报告质粒，并分别连接到pmirGLO载体上，构建成pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR和pmirGLO-AKT3-MUT-3’UTR。按照LipofectamineTM2000操作指南操作，将pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR或pmirGLO-AKT3-MUT-3’UTR联合miR-637 mimic或miR-637 NC共转染至TPC-1细胞中，24 h后检测细胞的荧光素酶活性。实验重复3次。

1.3实验分组TPC-1细胞接种于DMEM培养液中，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养至对数生长期。调整细胞密度，以每孔1.0×104个/孔接种于96孔板中，分为空白对照组(不转染)、阴性对照组(转染miR-637 NC)及miR-637组(转染miR-637 mimic)，每组设6个复孔。按操作手册进行转染，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中转染4～6 h，更换培养液后继续培养48 h。

1.4Western blot法检测细胞中AKT3蛋白的表达取3组细胞，RIPA裂解细胞并提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，变性后进行SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，用脱脂奶粉溶液室温封闭2 h后加入AKT3抗体(按1∶500稀释)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(按1∶500稀释)，室温孵育2 h。ECL显影，凝胶成像系统中曝光。以目的条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示AKT3相对表达量。实验重复3次。

1.5划痕实验检测细胞迁移能力分组处理48 h后，用胰蛋白酶将miR-637组和空白对照组细胞消化为单细胞悬液。在6孔培养板背面每隔0.5 cm画横线。分别在每孔中加入5×105个细胞，过夜。将直尺垂直于培养孔背后的横线，用移液枪枪头沿直尺在培养板上做划痕，PBS溶液洗涤划下的细胞，在37 ℃、体积分数5%CO2环境中培养，0、48 h后分别取样拍照，使用Image J软件分析划痕宽度变化。细胞迁移率=(0 h划痕宽度-48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。实验重复3次。

1.6Transwell小室检测细胞侵袭能力分组处理48 h后，取miR-637组和空白对照组细胞，分别加入无血清培养基孵育12 h，消化并离心，收集细胞，调整细胞密度为1×105个/mL。用基质胶包被Transwell小室，在含有体积分数5%CO2的培养箱中37 ℃孵育3 h，上室中加入细胞悬液100 μL，下室加入含体积分数30%胎牛血清的培养液500 μL继续培养24 h，PBS液冲洗，用多聚甲醛固定并用结晶紫染色，然后于光学显微镜下随机选取3个视野(×100)，计数穿膜细胞，计算均值。实验重复3次。

1.7统计学处理使用SPSS 22.0分析和处理数据。miR-637 NC组和miR-637 mimic组荧光素酶活性的比较采用两独立样本t检验；空白对照组、阴性对照组及miR-637组AKT3蛋白相对表达量的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验；miR-637组和空白对照组细胞迁移率及穿膜细胞数的比较采用两独立样本t检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1miR-637与AKT3靶向关系的验证TargetScan预测结果(图1)说明miR-637能够识别AKT3 mRNA 3’UTR的CCCCCAG序列，并与之互补配对。双荧光素酶报告实验结果(表1)显示，pmirGLO-AKT3-WT-3’UTR与miR-637 mimic共转染的细胞萤火虫荧光素酶活性下调，表明miR-637通过与野生型AKT3 mRNA的3’UTR结合，促进其降解，AKT3是miR-637的靶基因。

图1 生物信息学预测miR-637和AKT3的靶向关系

表1 双荧光素酶报告实验结果(n=3)

2.23组细胞中AKT3蛋白表达的比较Western blot结果见图2。空白对照组、阴性对照组及miR-637组AKT3蛋白相对表达量分别为(0.37±0.03)、(0.48±0.06)和(0.17±0.02)；3组比较，差异有统计学意义(F=40.526，P<0.001)；与空白对照组和阴性对照组比较，miR-637组细胞AKT3蛋白相对表达量降低(P<0.05)。

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：miR-637组

2.3划痕实验和侵袭实验结果见图3、图4和表2。与空白对照组相比，miR-637组细胞迁移率和穿膜细胞数均明显降低。

上：miR-637组；下：空白对照组

A、C：miR-637组；B、D:空白对照组

表2 2组细胞迁移率和侵袭细胞数的比较

3 讨论

PTC患者可通过放/化疗或外科手术进行治疗，但治疗后存在生活质量降低的风险[6]，并伴有预后不良或复发[7]，这主要是因为PTC具有增殖异常、凋亡受阻、侵袭能力强及淋巴结转移率高等特性[8-9]。因此，进一步探究PTC的发病机制，对临床开发治疗PTC的新方法至关重要。目前研究表明，已经有多种miRNA通过调节其下游靶基因的表达影响PTC的发展：miR-128通过负调控鞘氨醇激酶1抑制PTC细胞的生长[10]；miR-146b-5p通过靶向结合 CCDC6，促进PTC的发展[11]。miR-637是一个潜在的抑癌分子，且在人和小鼠中高度保守，可抑制胶质瘤、黑色素瘤细胞的增殖，同时可促进细胞凋亡[12-13]。另外，已有研究证明miR-637能够通过调控下游靶基因的表达发挥抗肝癌[14]、抗胆管癌[15]以及抗胰腺癌[16]的作用，但在PTC 中的作用尚不清楚。我们利用生物信息学软件分析发现miR-637与AKT3 mRNA的3’UTR 存在结合位点，提示AKT3可能是miR-637的靶基因；双荧光素酶报告实验证实两者存在靶向关系。研究[17-20]表明，AKT3在多种癌症中发挥原癌基因作用，如前列腺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等。miR-200a可通过抑制AKT3 mRNA的翻译影响胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力[21]。上调miR-203可通过下调AKT3表达，抑制PTC细胞的上皮-间充质转化、侵袭、增殖和迁移，诱导PTC细胞凋亡[22]。

我们以TPC-1细胞株为研究对象，应用miR-637过表达技术，观察其对AKT3表达的影响：Western blot检测结果表明miR-637过表达能够降低TPC-1细胞中AKT3蛋白的表达；划痕实验及Transwell实验结果表明miR-637过表达能够抑制TPC-1细胞的侵袭和迁移能力。综上所述，miR-637通过靶向作用于AKT3 mRNA的3’UTR，负性调控AKT3的表达，从而抑制甲状腺癌TPC-1细胞的侵袭和迁移能力。miR-637有望成为PTC治疗的新靶点。