王明月,胡财江*,安孟飞,申 畅,孙泽锐,赵云丽,王宣军,盛 军**

(1.云南农业大学 普洱茶教育部重点实验室,云南 昆明 650201;2.云南农业大学 理学院,云南 昆明 650201;3.云南农业大学 食品科学技术学院,云南 昆明 650201;4.云南大学,云南 昆明 650091)

骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种以骨量减少和骨微结构退变为特征从而致使骨骼脆性增加、骨折风险增加的代谢性骨骼疾病[1,2]。由于全球人口老龄化越来越严重,OP成为了一种日益普遍的疾病,并成为全世界存在的重大公共卫生问题[3,4],尤其是在绝经后妇女人群中发病的概率最大，因为在绝经后妇女的雌激素分泌水平下降，这会导致骨量减少，从而增加患骨质疏松症的风险[4-6]。目前我国治疗OP的方法主要是药物法,但它会引发一系列的副反应,因此日常保健对于OP的治疗作用重于服用药物。铁皮石斛是一种药食同源的中草药,具有极高的药用价值以及丰富的生理活性,包括降低患胃癌的风险[7]、增强免疫功能[8]、预防肝损伤[9]、抑制肿瘤活性[10]、抗炎[11]等作用,并且其多糖还具有降血糖[12]、降血压[13]以及具有有效清除自由基从而起到抗氧化活性[14,15]等生理功能。但是迄今有关铁皮石斛对骨质疏松症的治疗效果的报道较少,尤其是对骨微结构方面的影响报道几乎没有,鉴于此，笔者探讨了铁皮石斛提取物在改善切除卵巢小鼠的骨微结构方面的作用。

1 实验材料

1.1 实验动物

雌性SPF级ICR小鼠,体重在28～30 g,购自成都达硕实验动物有限公司,许可证号:SYXK(滇)K2013-0004。实验室温度在(24±1)℃,相对湿度为50%～60%。

1.2 样品与仪器

铁皮石斛茎在2011年收集于云南省,由普洱市民族传统医药研究所所长付开聪教授鉴定,并且凭证标本(2011-DPE-1)存于云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室。将石斛茎用打粉机粉碎,在80 ℃条件下温浸3次,每次1 h,3次的加水量依次为20倍、15倍、15倍。将滤液减压浓缩(-0.06～-0.08 MPa,50～70 ℃),将相对密度0.90～1.05(60 ℃)的提取物减压干燥(-0.06～-0.10 MPa,≤70 ℃)至干,粉碎,过80目筛,得深棕色粉末，即铁皮石斛提取物样品,其水分含量小于5%。在实验时取适量的铁皮石斛提取物样品，用双蒸水混悬定容至相应溶度，备用。戊酸雌二醇片,由Bayer公司生产。S1-114电子天平，由北京赛多利斯仪器有限公司生产。μCT100 Micro-CT，由瑞士SCANCO Medical AG公司生产。

2 实验方法

2.1 动物分组及处理

将72只小鼠按照随机区组法分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、雌二醇组(E2组)、铁皮石斛提取物低剂量组(DCE-Low组)、铁皮石斛提取物中剂量组(DCE-Medium组)和铁皮石斛提取物高剂量组(DCE-High组)。在分组后，模型组与处理组均摘除小鼠双侧卵巢,而假手术组仅切除小鼠两侧卵巢周围同样重量的脂肪组织。术后小鼠恢复1周，然后通过灌胃的方式给予样品,给予剂量分别为1.50 mg/kg(E2组)、0.35 g/kg(DCE-Low组)、0.70 g/kg(DCE-Medium组)和1.05 g/kg(DCE-High组),连续灌胃3个月,每周称重;在解剖前禁食12 h；在解剖后取小鼠左侧股骨进行影像学观察。

2.2 影像学检测

通过μCT 100 Micro-CT对骨质疏松模型小鼠的左侧股骨进行形态计量学分析，采集参数为:分辨率10 μm；曝光时间300 ms；电压70 kV；电流200 μA。

2.3 统计学分析

实验数据用均数±标准误表示。用SPSS 17.0和Graph Pad Prime 5处理实验数据；两组间的比较使用t-test,P值小于0.05代表有统计学差异。

3 结果与分析

显微CT分析的结果(图1)显示:与假手术组相比,模型组小鼠的骨小梁结构显著被破坏;而用雌二醇与铁皮石斛提取物低、中和高剂量分别给骨质疏松模型小鼠连续灌胃3个月后,与模型组相比,E2组(阳性对照组)小鼠的骨小梁结构改善不太明显,但是铁皮石斛提取物处理可明显改善小鼠由于切除卵巢而导致的骨小梁结构损伤的情况。

如图2所示：与假手术组相比，模型组小鼠的骨密度显著降低(P<0.05)；而用雌二醇与铁皮石斛提取物低、中和高剂量分别给骨质疏松模型小鼠连续灌胃3个月后,与模型组相比,E2组以及DCE-High组可明显改善小鼠由于切除卵巢而导致的骨密度下降的情况(P<0.05或P<0.01)。

如图3所示：Model组与Sham组相比,骨小梁厚度极显著降低(P<0.01)；而E2组和DCE-High组与模型组相比，骨小梁厚度显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01)。

如图4所示：Model组与Sham组相比,骨小梁分离度极显著增加(P<0.01)；E2组的骨小梁分离度与模型组相比有所增加(P>0.05)；但是DCE低、中、高剂量组与模型组相比，虽然没有统计学差异，但有降低骨小梁分离度的趋势(P>0.05)。

由图5可见：Model组与Sham组相比,骨小梁数目显著减少(P<0.05)；E2组与模型组相比，骨小梁数量略有减少；但是DCE三个剂量组与模型组相比，骨小梁数量有回升的趋势(P>0.05)。

从图6可以看出：Model组与Sham组相比,骨小梁体积比显著减少(P<0.05);E2组与模型组相比，骨小梁体积比几乎处在同一水平；但是DCE组与模型组相比，骨小梁体积比有所改善(P>0.05)。这些结果表明用铁皮石斛提取物处理小鼠可明显改善切除卵巢导致的骨微结构退变。

4 讨论

骨质疏松症已发展成为可引起大规模的临床和社会经济问题的一种具有全球挑战性的疾病[16]。前人研究已经证明目前治疗骨质疏松症的药物有一定的副作用并且在临床上受限制[6],因此探索从植物中提取的天然产物来替代药物的应用具有十分重要的意义。这些替代疗法可能表现出更好的活性和更少的副作用。药用植物铁皮石斛在以前的研究中就作为一种功能性食品和药物来使用[17],它主要含有石斛多糖、生物碱、氨基酸、微量元素和菲类化合物等有效成分[18]。之前有学者报道了铁皮石斛可以治疗多种病理疾病，包括免疫、炎症、癌症和高血糖[10,19]等,然而到目前为止有关铁皮石斛在治疗骨质疏松症方面的应用报道极少。

行卵巢切除术(OVX)诱导的小鼠是一个被广泛接受的绝经后骨质疏松症的实验模型,它可以模拟雌激素缺乏引起的人类骨丢失。这是一个非常经典的动物模型，已被广泛应用于研究绝经后骨质疏松并且由食品药品监督局推荐[20-22]。骨密度是检测骨质疏松症骨硬度和骨质量的重要指标[23,24];尽管早期研究已经证明了由OVX诱导的模型组小鼠与假手术组相比,骨密度会降低[25,26],但是本实验结果表明用铁皮石斛提取物处理小鼠可以防止小鼠股骨的骨密度下降。骨小梁体积分数表示骨组织体积与组织体积的比值,它能直接反映骨量的变化情况,同时也是评价松质骨骨量的常用指标之一[27,28]。据文献报道,在骨质疏松模型小鼠中,模型组的骨小梁体积分数与假手术组相比明显减少[29]；本实验也得到了同样的结果,但是用铁皮石斛提取物处理后小鼠的骨小梁体积分数明显有所改善。因为骨小梁的骨质量与骨微结构紧密相关,因此通过骨小梁的骨微结构可以计算出骨小梁厚度、骨小梁分离度以及骨小梁数目,这些参数是评价骨小梁空间形态结构的主要指标。前人研究表明,在OVX诱导的小鼠中,模型组小鼠与假手术组相比,骨小梁厚度与骨小梁数量明显降低，并且骨小梁分离度会增加[30-32]；但是本实验发现，用铁皮石斛提取物处理小鼠可以使这些参数得到改善。

总的来说,这项研究的结果表明连续12周灌胃给予小鼠铁皮石斛提取物可明显增加骨密度,改善骨质疏松小鼠的骨微结构。本实验仅从影像学分析了铁皮石斛对OVX小鼠骨微结构的影响,还需对其可能的作用机制进行进一步研究。