牟宏亮，吴小燕，昝强，杨锋，崔晓萍

陕西中医药大学，陕西 咸阳712046

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量减少，骨密度下降，骨强度降低，从而导致骨结构异常，骨脆性增加，持重减弱，易发生骨折为特征的慢性退行性骨疾病［1］。无论性别，可发生于任何年龄，但多见于绝经后女性和老年男性。OP是中国乃至世界最常见的骨骼性疾病和多发病。随着全球人口老龄化进程的加速，OP的发病率现已跃居慢性疾病的第3位，其高致残率严重影响着人们的生活质量［2-4］，亟需寻求有效的治疗方案。

OP可归属于中医学“肾虚”“虚劳”“骨痹”“骨痿”等范畴［5］，且该病的发生与肾关系密切。《医经精义》云：“肾藏精，精生髓，髓养骨，故骨者，肾之合也，髓者，精之所生也，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强。”可见，肾中精气充足是维持骨骼正常生长发育的关键。若肾精充足，骨髓生化有源，则骨骼强健有力；若肾精亏虚，骨髓生化乏源，骨髓空虚，则骨枯髓减，骨骼得不到濡养，骨软无力，脆弱易折，故临床治疗多以补肾为主。

经方左归丸作为补肾填精的代表方，临床用以治疗OP疗效确切，且多项临床观察及实验研究已从分子生物学水平证实其安全性、有效性及可靠性。现对左归丸治疗OP的相关研究进行总结概述，以便为后期的临床应用提供一定的参考。

1 临床研究

1.1 左归丸单药治疗OP的临床研究孙志英等［6］临床观察90例肝肾不足证OP患者，分别以左归丸汤剂和丸剂进行干预，6个疗程后，两组患者的生活质量（日常生活能力、社会活动能力、抑郁心理状态及焦虑心理状态）均较治疗前明显改善，视觉模拟评分法（visual analogue scale，VAS）评分显著降低，且丸剂组疗效明显优于汤剂组。欧阳峰松［7］观察肝肾阴虚型老年性OP患者100例，治疗组50例予以左归丸加减治疗，对照组50例则以口服钙尔奇D和阿法骨化醇片联合治疗。2个疗程后（3个月为1疗程），治疗组有效率为92.0%，明显高于对照组的72.0%；同时，两组患者的腰背疼痛程度及腰椎和股骨颈的骨密度变化均较治疗前明显好转，且治疗组疗效明显优于对照组。王如然等［8］观察30例左归丸治疗2型糖尿病合并骨质疏松肾阴虚证患者的临床疗效，发现经6个月治疗后，左归丸组总有效率为83.33%，明显高于单用钙尔奇D组的76.67%和对照组的33.33%；同时，左归丸组患者骨密度较对照组显著增加，血清骨钙素、甲状旁腺素和碱性磷酸酶水平显著降低，治疗骨痛的平均起效时间、平均缓解时间均明显缩短。

1.2 左归丸联合其他药物治疗OP的临床研究韩玉芬［9］临床观察102例绝经后OP患者，其中对照组51例予以口服阿仑膦酸钠片治疗，观察组51例在对照组的基础上予以左归丸治疗。6个疗程（4周为一疗程）后，与对照组相比，观察组腰椎及股骨近端骨密度显著升高，血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRAP5b）及组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）水平显著降低，表明左归丸联合阿仑膦酸钠片是通过降低血清TRAP5b及CTSK含量、提高腰椎及股骨近端骨密度水平治疗绝经后OP。孙福波［10］观察左归丸联合鲑鱼降钙素治疗78例老年性OP患者的临床疗效，对照组39例予鲑鱼降钙素治疗，观察组在此基础上予以左归丸治疗，持续给药3个月后，观察组显效28例，有效9例，有效率为94.87%，明显高于对照组的74.36%，发现左归丸结合鲑鱼降钙素可显著改善老年性OP患者的临床症状和骨密度，且疗效优于单纯使用鲑鱼降钙素。刘玉林等［11］使用左归丸联合阿法骨化醇、替勃龙治疗绝经后OP患者40例，6个月后，观察组有效率为87.5%，显著高于对照组（单用阿法骨化醇联合替勃龙）的67.5%。观察组患者股骨颈骨密度、腰椎正位骨密度及Wards三角区骨密度均较治疗前显著升高，骨钙素、骨碱性磷酸酶及TRAP等骨代谢指标水平显著下降，且各指标改善情况明显优于对照组。以上研究显示，左归丸可显著提高其他相关药物的疗效，且联合用药疗效优于单一用药。

1.3 左归丸治疗OP所致骨折的临床研究李超［12］临床观察90例骨质疏松性椎体压缩性骨折椎体后凸成形术（percutaneous kyphoplasty，PKP）后患者，随机分为3组，分析比较患者的VAS评分、腰痛ODI评分标准（the oswestry disability index）、骨密度水平以及邻近椎体骨折的发生率，发现左归丸联合唑来膦酸能明显缓解PKP术后患者腰背部的疼痛，改善患者腰部功能障碍，提高骨密度水平，降低邻近椎体骨折再发生率。江和明［13］将60例骨质疏松性椎体压缩性骨折患者随机分为两组，对照组30例采用经皮双侧球囊扩张椎体成形术，治疗组在对照组的基础上予以左归丸治疗。通过对两组患者术后3 d、2个月的VAS评分和疗效进行评价，发现术后2个月治疗组有效率为96.67%、治愈率为36.7%，明显高于对照组70.0%的有效率和10.0%的治愈率，可见左归丸对OP所致骨折具有较好的疗效。

2 实验研究

破骨细胞和成骨细胞是骨组织代谢的基本功能细胞，对骨的生长或吸收起着调控作用。成骨细胞的骨形成作用与破骨细胞的骨吸收作用是维持骨骼重建的基础，若两者之间的“动态平衡”被破坏，骨吸收作用强于骨形成作用，则会导致OP的发生［14-15］。研究证实，左归丸可通过影响破骨细胞的骨吸收及成骨细胞的骨形成防治OP。

2.1 左归丸通过抑制破骨细胞的骨吸收治疗OP

2.1.1 通过调节破骨细胞分化调控因子骨保护素（osteoprotegerin，OPG）及核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）抑制破骨细胞李强等［16］体外分离培养破骨细胞和成骨细胞，并制备卵巢切除加左归丸组、卵巢切除组及对照组大鼠的含药血清，分别对其进行干预。通过检测比较破骨细胞所引起的骨吸收陷窝数目和面积、OPG及破骨细胞RANKL蛋白的表达，发现左归丸含药血清可对破骨细胞产生直接的抑制作用，同时可促进OPG表达，抑制RANKL活性，并可通过成骨细胞间接抑制破骨细胞，从而防治OP，此与刘梅洁等［17］的研究结果基本一致。此外，刘飞祥等［18-19］发现左归丸可通过调节β2肾上腺素受 体（β2 adrenergic receptor，β2AR）介 导 的RANKL／OPG信号通路，降低大鼠血清中Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列（βcross-linked C-telopeptide of typeⅠcollagen，β-CTX）水平，提高骨特异性碱性磷酸酶水平，增加骨量，改善股骨远端骨小梁显微的结构。吴佳莹等［14］采用切除双侧卵巢法制作OP模型大鼠，予以左归丸干预3个月后，发现左归丸组与模型组大鼠相比，胫骨骨量显著增加，骨吸收（骨小梁吸收表面百分比）和骨形成（骨小梁形成表面百分比、类骨质平均宽度、骨小梁矿化率、骨皮质矿化率）水平明显降低，且大鼠肝组织中铁调素mRNA及胫骨骨髓中OPG mRNA的表达强度明显增高，而铁泵蛋白Ferroportin1和RANKL mRNA表达强度则明显下调。得出结论：左归丸可通过提高铁调素的表达水平，促使其与受体铁泵蛋白Ferroportin1结合，调节下游的信号通路OPG／RANKL，使OPG表达上调，RANKL表达下调，从而抑制破骨细胞活性，达到治疗OP的目的。

2.1.2 通过调节瞬时受体电位通道V5（transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 5，TRPV5）抑制破骨细胞的骨吸收有研究发现，机体具有钙离子跨膜转运的组织及器官几乎均有新型钙离子通道TRPV5的参与［20］。TRPV5可参与调节整个机体的钙平衡，介导破骨细胞的分化过程，并与OP钙代谢紊乱现象具有一定的联系［21］。唐皓等［22］通过切除大鼠卵巢造模研究左归丸治疗OP的作用机制，并通过蛋白免疫印迹法检测骨组织TRPV5、钙结合蛋白D28K、钠钙交换器1和细胞膜钙汞蛋白的表达，发现与模型组相比左归丸组上述蛋白的表达水平均明显下降，且以左归丸高剂量组下调最为显著。进而证实左归丸可通过降低破骨细胞中TRPV5、钙结合蛋白D28K、细胞膜钙汞蛋白、钠钙交换器1等蛋白的表达水平，抑制破骨细胞的骨吸收，从而起到抗OP作用。

2.1.3 通过调节炎症因子抑制破骨细胞活性初始T细胞在白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白细胞介素-23（interleukin-23，IL-23）的刺激下，可分化形成辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17），而Th17分泌IL-17A可触发机体局部炎症反应，并产生肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎性细胞因子，促进破骨细胞形成，导致骨质流失［23］。有研究显示，IL-17与绝经后OP的发生关系密切［24］。谢宝华等［25］发现绝经后妇女骨密度下降，Th17／调节性T细胞（regulatory cells，Tregs）亚群向Th17偏移。予以左归丸治疗后，患者骨密度明显增加，Th17亚群特异性核转录因子蛋白表达下调，Treg亚群特异性核转录因子蛋白表达上调，进而证实左归丸可诱导Th17／Treg亚群向Treg偏移，抑制溶骨性细胞因子的产生，从而减少骨丢失。刘立萍等［26］研究发现左归丸干预组去卵巢大鼠血清中TNF-α、IL-17、RANKL水平较模型组大鼠显著降低；通过TRAP染色法检测股骨组织破骨细胞数量，发现左归丸干预组大鼠较模型组明显减少，HE（hematoxylin-eosin staining）染色法观察发现左归丸干预组大鼠股骨骨小梁结构、形态基本正常，破骨细胞数目明显减少，骨小梁狭窄。陈剑磨等［27］以左归丸混悬液给去势OP大鼠灌服12周后，发现左归丸组大鼠腰椎椎体组织中TNF-α、IL-1与IL-6 mRNA表达水平较模型组显著下降。以上研究结果表明，左归丸可通过调节炎症因子、抑制破骨细胞活性进而达到治疗OP的目的。

2.1.4 通过抑制TRAP进而抑制破骨细胞活性TRAP主要由破骨细胞分泌表达，是破骨细胞的活性标志物，在OP患者中呈高表达状态。左归丸则可通过抑制TRAP的活性，防止骨丢失，从而起到治疗OP的作用［28-29］。刘立萍等［28］通过实验研究发现，左归丸可能是通过下调破骨细胞功能标记分子T细胞核因子2的蛋白表达抑制TRAP，从而达到抑制破骨细胞活性的作用，以防治老年性OP。

2.2 左归丸通过促进成骨细胞的骨形成治疗OP成骨细胞是骨形成和重建过程中的主要功能细胞，可分泌骨钙素、骨桥蛋白、OPG等生物活性物质，参与骨基质的合成、分泌和矿化，调节并影响骨的形成和重建过程［30］，同时可调节破骨细胞的活性和功能，维持骨代谢平衡。若成骨细胞的增殖受到抑制，可直接导致骨形成减少而引发骨质疏松［31］。左归丸可通过调节细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38丝裂原活化蛋白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、转化生长因子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）、Wnt／β-catenin等信号通路，诱导成骨细胞增殖与分化以防止骨损失，治疗OP。

2.2.1 左归丸与ERK信号通路有研究发现，人体骨骼重建的过程需要多种激素共同调节，而雌激素在骨代谢过程中发挥着重要作用。盛斌等［32-33］通过研究证实，雌激素可通过诱导成骨细胞MC3T3-E1碱性磷酸酶活性、骨桥蛋白、OPG及骨钙素等的生成而调节成骨细胞骨形成。刘立萍等［34］以左归丸含药血清对成骨细胞MC3T3-E1进行干预，同时使用雌激素受体拮抗剂共孵以阻断雌激素受体（estrogen receptor，ER）。通过采用Western-blot法检测各实验组ERα、ERK、p-ERK和Osterix蛋白表达水平，发现左归丸含药血清组、左归丸去补阳药含药血清组ERα、ERK、p-ERK和Osterix蛋白表达水平均上调。研究结果进一步表明，左归丸含药血清可通过上调成骨细胞ER激活ERK信号通路，促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖、分化和矿化。该研究与章建华等［35］的结果一致。临床多项研究已证实，左归丸具有促进雌激素分泌、提高雌激素受体表达、改善低雌激素相关症状等类雌激素样作用，故表明左归丸可通过调控ERK信号通路促进成骨细胞的增殖进而达到治疗OP的作用，且对于绝经后OP尤为适宜。

2.2.2 左归丸与p38MAPK信号通路p38MAPK信号通路在成骨细胞增殖与分化的过程中起着重要作用。各种炎症因子刺激p38MAPK信号通路使其激活，可调节碱性磷酸酶的表达，促进成骨细胞分化、成熟，从而调控骨形成［36-37］。刘立萍等［38］通过实验研究探讨p38MAPK信号通路对左归丸含药血清干预MC3T3-E1成骨细胞分化的影响，发现左归丸含药血清可促进MC3T3-E1成骨细胞分化，明显上调碱性磷酸酶蛋白表达水平；于左归丸含药血清组添加p38特异阻滞剂SB203580后，成骨细胞的分化作用受到抑制，碱性磷酸酶蛋白表达水平下调。该研究证实了左归丸可通过p38MAPK信号通路干预MC3T3-E1成骨细胞分化，促进骨形成。研究进一步证实了左归丸可通过上调MC3T3-E1细胞p38磷酸化蛋白的表达水平，激活p38MAPK信号通路，促进成骨细胞矿化、增殖，促进骨形成，进而达到治疗OP的目的［39］。

2.2.3 左归丸与TGF-β1／Smads信号转导通路TGF-β1／Smad信号通路可参与成骨细胞的增殖和分化过程［40］。石义刚等［41-42］通过研究也已证实TGF-β可通过影响OPG调节成骨细胞的增殖与分化。同时，TGF-β可通过与成骨细胞表面的TGF-β受体结合，促进成骨前体细胞分化为成骨细胞和矿物质沉积于骨小梁，进而减少骨损伤［43］。艾思羽［44］通过切除大鼠双侧卵巢建立绝经后OP动物模型，发现模型组骨组织中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ及其下游信号转导分子Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达水平下调，Smad7蛋白表达水平升高；予以左归丸及其拆方进行干预后，TGF-β信号通路中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达水平较模型组明显增加，Smad7蛋白表达水平显著下降。同时，通过骨组织形态学观察发现，药物干预组大鼠骨小梁变粗、增宽，数目增多，小梁间连接性改善，排列较紧密，证实左归丸可通过TGF-β1／Smads信号转导通路提高骨密度进而达到治疗绝经后OP的目的。该结果与盛斌等［32-33］的研究一致。可见，左归丸可通过调节TGF-β1／Smads信号通路促进成骨细胞增殖分化，提高骨密度，治疗OP。

2.2.4 左归丸与Wnt／β-catenin信号通路Wnt／β-catenin信号通路，又称经典Wnt通路，由Wnt蛋白、膜受体卷曲蛋白、细胞膜上的共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5／6和β-catenin等组成，可诱导成骨细胞的形成及分化。当Wnt／β-catenin信号通路传导异常，会导致骨代谢失常，进而发生OP［45］。韩学明等［46-47］临床观察发现绝经后OP患者β-catenin蛋白表达水平低下。李玲慧等［48］通过提取新生SD大鼠颅盖骨处的成骨细胞并以左归丸含药血清进行干预，结果发现左归丸组成骨细胞β-catenin蛋白表达水平明显高于模型组。章建华等［35］通过实验研究也证实了这一点。左归丸可通过促进β-catenin蛋白水平的表达，激活Wnt信号通路，促进成骨细胞增殖，进而达到治疗OP的作用。此外，张志达等［49］发现左归丸可通过下调Wnt／β-catenin 信 号 通 路 抑 制 剂 拮 抗 蛋 白Dickkopf-1的表达来防治糖皮质激素性OP的发生。

3 总结

综上所述，左归丸可通过多种分子通道调节破骨细胞的骨吸收与成骨细胞的骨形成作用，使两者相互作用，达到稳定的平衡状态，进而发挥减轻OP患者骨疼痛程度、促进骨发育、增加骨密度、提高骨强度的作用。目前，西医治疗OP主要以钙剂、维生素D和骨吸收抑制药物（包括雌激素、选择性雌激素受体调节剂、双膦酸盐等）为主，需长期服用才可发挥临床疗效。然而长期服药会增加心血管疾病、血栓疾病及妇科癌病等的发生率，且费用昂贵，患者往往比较抗拒。与西医治疗相比，临床应用左归丸治疗OP疗效确切，不良反应较少，安全性高，患者依从性好，可长期服用，具有多靶点、多途径干预的特点，是临床防治OP的良好选择。但目前左归丸治疗OP的效应机制仍需更深层次、更全面的研究探讨。因此，今后可基于中医理论进行多方面、多靶点的实验研究；在临床上，对已形成的试验结论合理应用，采用循证医学研究方法，优化临床试验设计方法；开展前瞻性、大样本、多中心的临床研究；同时对症状评价加强标准化，以提高其临床应用价值。