基于DNA甲基化调控的中医药防治动脉粥样硬化的研究进展*

2021-04-17何贵新秦伟彬莫霄云邓学秋陈天宇任加以玉黎燕申永艳

中医药导报 2021年2期

肖婷，何贵新，秦伟彬，莫霄云，林琳，邓学秋，陈天宇，任加以，玉黎燕，申永艳

（1.广西中医药大学，广西南宁 530299；2.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁 530022）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病常见的发病基础，发病机制复杂，不仅与多基因遗传相关，也受环境因素影响，尽管以调脂、抗血小板凝聚防治动脉粥样硬化的治疗方法不断推进，但防治效果往往不理想，而中医药在临床治疗中具有多靶点和全方位的作用特征，新近研究发现中药单体成分和复方通过作用于DNA甲基化可有效治疗AS[1]。随着现代研究技术的发展，从分子生物学角度研究中医药对动脉粥样硬化关键靶标的甲基化调控作用也越来越受重视，这也有助于进一步阐释动脉粥样硬化发病机制、疾病风险评估及发现早期诊断的新的分子标志物，同时还能为疾病治疗提供新的途径。DNA甲基化的调控作用研究已成为生命科学中普遍关注的前沿领域。本文对近年来相关研究进行如下综述。

1 DNA甲基化

1.1 DNA甲基化：潜在的诊断标志物或治疗靶点DNA甲基化是一种已被广泛研究的表观遗传调控机制，是后基因组时代生命科学领域的重要组成部分，在基因转录中扮演着重要角色。DNA甲基转移酶（DNA methyltransterase，DNMT）的催化作用下激活胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤双核苷酸序列分布呈现高度密集状态的基因CpG岛，利用S-腺苷甲硫氨酸作为供体，将DNA甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤（CG）二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上，并与其3'端的鸟嘌呤形成mCpG，导致DNA结合蛋白与DNA主螺旋沟的结合能力降低，发生DNA甲基化，使某些区域DNA构象变化，阻止转录因子与启动子结合，进而在不改变基因构造的前提下，造成基因转录过程受到抑制，使基因“沉默”。DNMTs是一种主要在大脑中存在的酶，DNMT家族在DNA甲基化修饰过程中起到了非常重要的调控作用，当前发现中，DNMTs家族中主要是DNMTI、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、DNMT3C和DNMT3L，但只有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B具有甲基转移活性[2]。如果在启动子区域发生DNA甲基化，导致染色体结构不稳定甚至构象发生变化、转座子异常表达或基因表达活性下降甚至丧失[3]。

近年来，随着DNA甲基化检测技术的不断发展和完善，人们逐步认识到差异性DNA甲基化在基因调控、蛋白质表达、胚胎发育、个体生长中起重要作用，并且在各系统疾病中的研究也已得到认可。DNA甲基化修饰通过多种途径调控特定基因的表达，维持细胞结构的稳定性。反之，一旦甲基化修饰过程中的任何一个环节出现异常，相应疾病也随之出现[4]。大量的研究表明，DNA异常基因甲基化与人类衰老、心脑血管疾病、代谢异常疾病、各种肿瘤等关系密切，DNA基因甲基化是上述疾病发生发展的一个早期事件，并贯穿于整个疾病发生发展过程[5-6]。因此，可以通过检测DNA基因的异常甲基化作为筛查疾病的生物标志物，更好为疾病找到具体的治疗靶点提供依据，为后期药物开发提供参考。

1.2 DNA甲基化在动脉粥样硬化中的作用动脉粥样硬化（AS）是一种由多病因引起的慢性炎性疾病，以内皮细胞损伤、脂质浸润、血管平滑肌细胞发生迁移和增殖为主要特征，累及心脑等重要器官，是心脑血管疾病发生的主要因素[7]。但是关于AS的发病机制尚不完全清楚，主要观点为AS是由多种因素共同作用的结果，包括血流动力学改变、脂质代谢异常、血管内皮损伤、物理化学因素及遗传因素等[8]。当前，基于AS发生发展的“炎症”和“脂质沉积”学说而开发的抗炎和降脂药物已成为临床上治疗AS的基石。然而，单纯的药物抗炎和降脂作用越来越有限，而且一些患者已经表现出耐药性。因此，需要探究AS发生发展更深层次的影响机制调控过程，寻找能够为临床提供更加有效的预防AS的方法。随着现代分子生物学、基因组学及表观遗传学技术的快速发展，疾病的治疗已不只局限于通路靶点的研究，而扩展到微观分子水平。当前表观遗传学的调控作用成为新的治疗靶点和热点，AS机制研究也取得一些进展。研究[9]发现，AS中出现异常DNA甲基化的异常表达，在AS的斑块形成、调控单核/巨噬细胞、血管内皮细胞（endothelial cell，EC）和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）功能及AS的病变程度等中均具有重要的功能。目前很多研究发现，基因DNA甲基化的改变与AS关系密切。DNA甲基化通过调节某些被甲基化区域的基因表达和血管平滑肌细胞的分化，从而影响AS的形成。对AS相关基因甲基化的研究已成为当今热门趋势，AS的发生发展是多个基因甲基化及不同基因不同甲基化水平联合作用的结果。迄今为止，主要是关于雌激素受体相关基因、免疫相关基因、成纤维细胞生长因子、脂质相关基因及其他影响因素的研究。具体如下：

1.2.1 DNA甲基化参与平滑肌细胞增殖雌激素在未绝经妇女中具有保护心血管的作用，原因是雌激素激活后，使一氧化氮合酶基因表达上调，可以很好地抑制血管平滑肌增殖和迁移，具有抗动脉粥样硬化作用，也与调节脂质代谢有关。有研究表明，AS患者体内雌激素受体基因的启动子CpG岛存在高甲基化现象，造成基因沉默，使其抗AS作用降低或丧失[10]。另外有研究发现，HILTUNEN M O等[11]在新西兰兔的动脉粥样斑块及增殖的血管平滑肌细胞中发现，其基因组的甲基化水平较正常对照组普遍降低，同时发现基因组平滑肌细胞增生明显，影响AS病变的发展过程。HUANG Y S等[12]研究发现，AS患者的雌激素受体启动子区发生甲基化为水平70.4%，而正常对照组仅为28.6%。可以证实的是，异常的DNA甲基化水平参与血管平滑肌细胞的增殖和迁移，进而影响动脉粥样硬化斑块的形成。

1.2.2 DNA甲基化参与脂质形成AS主要因胆固醇的长期积累，血小板凝集，发生粥样改变。有研究表明[13]，AS患者体内白细胞中的三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1基因启动子序列存在异常的高甲基化状态，介导细胞内胆固醇和磷脂流出并转运至载脂蛋白A-1（apolipoprotein-1），使血浆中高密度脂蛋白及胆固醇水平增高，证明了三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1基因高甲基化参与脂质代谢，从而与AS的形成具有密切关系。

1.2.3 DNA甲基化调控炎症反应AS是以巨噬细胞浸润，T细胞异常和血管内皮功能受损为主要特点的多病因慢性炎症反应。AS可以导致血管的阻塞、心肌梗死、外周血管疾病、动脉瘤和脑梗死等疾病[14]。AS的发生及发展与异常基因甲基化关系密切，而这些异常基因甲基化包括异常的高甲基化与低甲基化。基质金属蛋白酶9是一种重要的炎症介质和细胞外基质代谢酶，当其发生异常高表达或者活性增强时，会影响AS病变进展过程，甚至出现急性恶化。研究[15]表明，冠状动脉粥样硬化性心脏病患者基质金属蛋白酶9基因启动子区域甲基化水平明显低于正常对照组，该浓度也显著升高，这提示基质金属蛋白酶9基因参与AS的形成机制。贾镭等[16]研究发现，调节性T细胞（Treg）在抑制AS的形成和进展中具有重要作用，随着冠状动脉粥样硬化病变程度加剧，Treg水平也显著降低。LI Z B等[17]研究表明，micro RNA-223基因低甲基化与脑梗死密切相关，在23例脑梗死患者中进行microRNA-223基因启动子甲基化水平，结果显示，与健康组比较，脑梗死患者microRNA-223基因启动子甲基化水平明显降低。近期研究发现，micro RNA-223基因在AS等疾病中扮演重要角色。

1.2.4 DNA甲基化参与AS相关危险因素同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是AS的独立危险因素之一，通过损害血管内皮细胞、刺激平滑肌细胞增生、血脂异常及血管的氧化应激反应，对AS血管病变造成影响，成为心血管风险指标之一。研究证实，当体内缺少维生素B及叶酸时，血浆中的Hcy水平升高[18]。LI J J等[19]研究表明，高水平Hcy能降低AS患者体内的总甲基化，参与炎症介导引起的血管内皮损伤。另外一项研究也证实了这一点，SHARMA P等[20]检测137例冠心病患者和150名健康人外周血总DNA甲基化，发现冠心病患者总DNA甲基化水平明显高于健康人，且与Hcy水平呈正相关。此外，吸烟是心血管疾病的重要危险因素。ZHANG Y等[21]指出，吸烟与DNA甲基化密切相关，引起DNA甲基化的变化，使基因表达异常，参与疾病的发生，增加心血管疾病的全因死亡率。

2 DNA甲基化的“微观”表象是中医学研究的切入点

近年来，关于DNA甲基化的研究思路被逐渐应用于中医药研究中，表观遗传学的“微观”研究已成为中医学研究的切入点，包括用于从微观角度解释中医证候、中医经典理论、中药的作用机制等方面。

2.1 “天人相应”与DNA甲基化用现代科学语言来阐释中医药理论是非常困难的，这也是困扰现代中医药研究者的一大难题，随着表观遗传学的发展及应用，为中医药传统理论提供了新的解读。中医学将人体与外部环境看成一个整体，即“天人相应”，天人相应与中医学的整体观密不可分。中医注重整体辨证施治，主张“天人合一”，在《易经》中[22]有“夫大人者，与天地合其德，与日月合其明，与四时合其序，与鬼神合其吉凶，先天而天弗违，后天而奉天时，天且弗违，而况于人乎”的论述，指出人不能与天道相违，要顺应自然。《三因极一病证方论》中提出“内因、外因、不内外因”致病学说，均着力于人先天之质与后天之邪产生疾病的关系。研究[23]发现，对雌性幼鼠进行高糖牛奶饮食后，成年后可导致高胰岛素血症和肥胖，并且这些表现型可以遗传给它的子代，但是通过相应的饮食控制就可以再次改变，甚至可以在子代中得到预防，说明表观遗传学是可逆的。表观遗传学强调遗传因素和环境因素相互作用，与中医学对人体内外环境整合同一的重视，二者的理念渐趋一致，方法各异，可以互相借鉴，共同发展。这也是中医的整体治疗观和单靶点疗法在疑难杂病治疗中比较，前者更具令人兴奋的疗效原因所在，也突出中医学对疾病认识的科学性。

DNA甲基化与地域密切相关。如《素问·五常政大论篇》明确指出：“一州之气，生化寿夭不同，其何故也?歧伯曰：高下之理，地势使然，崇高则阴气治之，污下则阳气治之。阳胜者先天，阴胜者后天，此地理之常，生化之道也。……高者其气寿，下者其气夭，地之小大异也，小者小异，大者大异。”不同区域内的气候条件、地理环境、起居饮食习惯等因素对于生活在该区域内的人和生物有着不同的影响，使该区域内所有的人具有某些共同的体质特点，这些体质特点又进一步决定了该区域内群体的病理变化倾向。这些体质特点、病变规律和治疗方法就是这种群体特征与天相应的反映所在。通过研究[24]发现，对60例母亲妊娠早期经历过荷兰饥荒所生的孩子与兄弟姐妹比较，发现胰岛素样生长因子2甲基化区域位点存在显著差异。这也说明了环境的变化可以造成基因甲基化修饰的变化，这也与中医学因地制宜的观点不谋而合。

2.2 “阴阳自和”与DNA甲基化《素问·上古天真论篇》记载：“上古有真人者，提挈天地，把握阴阳，呼吸精气，独立守神，肌肉若一，故能寿敝天地，无有终时。”中医药治疗主张调和阴阳，治病所求的根本即在于“阴阳”。阴阳是是对自然界相互关联的某些事物或者现象对立双方属性的概括，在构建中医学理论体系、形成中医学思维模式中发挥了不可替代的作用。从微观角度看，阴阳失调的部分现代生物学基础在于DNA甲基化的失控（包括异常的高甲基化与低甲基化），通过调控基因的转录及其表达水平，“损其有余，补其不足”，使之重新恢复平衡状态，是谓《素问·至真要大论篇》中“谨察阴阳所在而调之，以平为期”。中医阴阳自和的理论为治疗心血管疾病提供了新的思路，也将为中医学“治病求本”的研究开辟了新的方向。

《素问·生气通天论篇》云：“凡阴阳之要，阳密乃固。两者不和，若春无秋，若冬无夏。因而和之，是谓圣度”“内外调和，邪不能害”，阴阳是相对的，可以相互转化。阴阳的相互转化是事物发展的又一过程，在一定的条件下可以向其各自相反的方面转化，即阳可以转化为阴，阴也可以转化为阳，“物极谓之变”就是这个道理。《黄帝内经》把重和极概括为是引起阴阳转化的“拐点”，医生要准确地认识、把握和利用阴阳转化的“拐点”，从而有效地防止疾病恶化，或使已经恶化的病情得到逆转，这种阴阳转化规律是广泛存在的。表观遗传方面的可逆性和转化性，如组蛋白在组蛋白乙酰基转移酶（HATs）作用下发生乙酰化，而在组蛋白去乙酰化酶（HDACs）作用下又可以出现去乙酰化，乙酰化是组蛋白的重要修饰方式，受HATs和HDACs的共同调控，这一特性与阴阳转化之间的关系具有异曲同工之妙。现代研究[25]发现，异常的高甲基化与低甲基化基因之间的共存模式是众多疾病共同的病理基础。这与中医学对疾病阴阳失调的总体认识极为相似，我们有理由相信，中医阴阳的分子生物学基础可能在于DNA高甲基化与低甲基化。因此，从中医“阴阳自和”的角度出发，调节疾病异常的高甲基化基因与异常的低甲基化基因，使其恢复正常，对于疾病的治疗具有重大意义。

3 中医药对动脉粥样硬化DNA甲基化的作用

3.1 中医学对于动脉粥样硬化的认识中医学虽无“动脉粥样硬化”的病名，但有关其证候和病因病机在历代文献中早有记载，多见于中医学的“胸痹”“脉痹”“中风”等范畴。“脉痹”始见于《黄帝内经》。《黄帝内经》云：“经脉者，所以能决死生，处百病，调虚实，不可不通。”大多数学者均认为本病为本虚标实之证，本虚病位主要在肝、脾、肾三脏，其虚主要指气虚、阴虚、阳虚，标实即痰浊、瘀血、热邪、毒邪等。《金匮要略》记载：“心下有支饮，其人苦冒眩，泽泻汤主之。”基于痰浊致病的证候特点，由于机体功能失调导致产生致病产物引发疾病的产生，而致病产物又可以反过来作为新的致病因素加速病情的发展与恶化，造成更大的危害。另外有研究[26]证实，痰浊与血脂具有一定的相似性，高脂血症、动脉硬化指数、痰浊证及血脂指标互相之间存在密切的关联性。痰浊的致病机理与氧化应激过程类似。《素问·痹论篇》指出：“痹在于脉则血凝而不流”。另外，《医学纲目》记载：“中风皆因脉道不利，血气闭塞也。”均表明“血瘀致经脉闭阻”也是动脉粥样硬化的生物学基础，引起相关血流动力学障碍是发生AS的直接因素。

随着众多中医学者对本病病因病机更深入的探讨，对其也产生了许多新的认识，如认为“伏邪”“脉浊”是AS硬化的另外病因，参与AS的形成和发展[27]。人体内的邪气未能及时清除，或邪气潜伏于脉府，日益积聚增多，待时而发，待机而作，即谓之“伏邪”，正虚之时导致脉府损伤。血中之脂质为水谷精微中厚浊且富有营养的部分所化，适当则为身体所之需，过多则为邪为害。浊邪留滞脉道，积聚日久为痰、为瘀、为热、为毒。现代研究认为AS的病因及发病机制复杂，高血脂是主要因素，通过损伤血管内皮、刺激平滑肌细胞增生、致血管壁细胞凋亡等多种机制相互作用下损伤动脉血管，同时中医学的“脉”与西医的循环系统也存在高度相关性。

因此，将“伏邪”“脉浊”与AS联系起来，使之既与现代医学的认识互通，又符合传统中医理论，使临床实践中的辨证与辨病能够更好地结合起来，从而可以更好地利用中医方法对AS干预，解决目前临床问题。

3.2 中药调控DNA甲基化防治动脉粥样硬化动脉粥样硬化是威胁人类生命及健康的严重疾病之一，是许多疾病的“罪魁祸首”，因此开展针对AS防治研究具有重要意义。现代医学在AS防治方面效果往往不理想，降脂药物常伴有明显的毒副作用，甚至导致肝肾功能异常。与西药比较，中药具有作用多靶点、毒副作用小等优点。中药通过调节血脂、抗氧化应激、抗血小板聚集、抗血栓及抗平滑肌细胞增殖等途径，干预AS发生和发展的各个环节，在AS防治中具有较好的效果。中药是我国传统文化发展的重要医药历史宝库，然而临床上中药用于治疗AS具体机制还需要进一步探索，这将对促进中医药现代化发展有着重要的意义。随着对中药有效成分抗AS研究的不断深入，其机制的研究也日趋广泛，已从整体组织器官水平，深入到细胞、分子、基因表达与调控水平，当前越来越多的研究表明，中药通过调控DNA甲基化修饰过程，从而治疗疾病[28]。

3.2.1 中药单体成分调控DNA甲基化对AS的影响DNA甲基化作为表观遗传学的关键部分，其可通过调节特异性基因的表达，进而干预AS的发生发展。KUMAR U等[29]研究发现，姜黄素通过影响DNA甲基转移酶3b（DNA methyltrans-ferase 3b，DNMT3b）的转录水平，进而调控乳腺癌细胞SK-BR-3的DNA甲基化水平，从而抑制癌细胞生长，这充分表明姜黄素在癌细胞中具有很好的去甲基化作用。姜黄素是从姜科植物的根茎姜黄中提取的一种酚类色素，是一种很好的DNA甲基化抑制剂，其具有多种生物学活性，如抗氧化、抗炎、抗凝、抑制血管平滑肌细胞的增殖、抗动脉粥样硬化，还具有明显的抗肿瘤作用。同时，研究[30]发现姜黄素与DNMT1发生共价结合来抑制DNA甲基转移酶的表达，使18 SRRNA基因启动子发生甲基化，影响核糖体DNA转录，抑制血管平滑肌细胞的增生，起到稳定AS斑块的作用。另一研究[31]发现中药成分栀子苷可以调控ox-LDL诱导的泡沫细胞异常基因甲基化，使得泡沫细胞的增殖受到抑制，影响多个与AS相关功能通路，同时起到降脂作用，进而发挥出抗AS作用。总之，中药单体成分可以通过对DNA甲基化的调控作用影响AS的发展。

3.2.2 中药复方成分调控DNA甲基化对AS的影响目前中药复方是动脉粥样硬化DNA甲基化的主要研究方向。例如，赵伟峰等[32]发现在通过中药作用DNA甲基化稳定粥样斑块的基础研究中，血府逐瘀胶囊（主要由桃仁、红花、赤芍、川芎等组成）、四季三黄胶囊（由大黄、黄芩、黄柏、栀子组成）二者联合作用可使得体内甘油三酯的含量降低，同时提高AS小鼠模型的整体血清DNA甲基化水平和DNMTS水平，增加斑块的稳定性。此外，中药复方对血管平滑肌细胞DNA甲基化也具有调控作用。如程修平等[33]研究发现稳斑汤（主要由全蝎、蜈蚣、地龙、水蛭等组成）联合西医常规治疗可显著降低冠心病患者血浆血栓调节蛋白（TM）基因启动子甲基化水平，促进TM基因表达，增强抗凝作用，保护血管内皮细胞，稳定动脉粥样硬化斑块。因此，中药复方的有效作用可能是通过调控DNA甲基化来抑制动脉粥样硬化。积极发挥中医药的独特优势，从分子水平深入研究中医药调控DNA甲基化干预动脉粥样硬化的作用机制，将是可行的。