许瑶函 综述 韩伟 审校

浙江大学医学院附属第一医院眼科，杭州 310003

青光眼是以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)进行性死亡及其轴突慢性退化为特征的神经退行性疾病，是全球主要的致盲眼病之一[1]。原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)是常见的青光眼类型，常伴有眼压升高，小梁网功能障碍导致房水流出受阻是其致病因素之一[2]。病理性眼压升高是青光眼发生视神经损害的主要危险因素。眼压升高通过直接压迫视盘区域对其造成机械性损害，同时导致该区域血流灌注减少，发生氧化应激和能量供应障碍等。降低眼压是目前临床上延缓青光眼病程的有效治疗手段[3]。然而现有的临床资料表明，青光眼患者眼压即使正常或通过治疗得到良好控制后，仍会发生持续性视神经损伤，这说明青光眼不仅与眼压升高有关，还可能包含独立的神经变性成分[3-5]。近年来自噬受到研究者的广泛关注，其在青光眼相关领域的研究也逐渐增多[6-8]。本文对自噬在青光眼发病机制中的最新研究进展进行综述。

1 自噬

1.1 自噬的定义及分类

自噬是在进化上高度保守的复杂生理过程，是一种细胞降解、回收机制。自噬可以降解异常的细胞器及长寿蛋白，并将氨基酸、脂肪酸等大分子成分回收利用作为新的能源供应，从而维持细胞稳态。在饥饿、缺氧等条件刺激下，自噬会被迅速激活[9]。过度自噬或自噬受损均可能导致细胞功能障碍，甚至死亡[10]。自噬在哺乳动物细胞中根据底物与溶酶体结合方式的不同分为经典自噬(巨自噬)、微自噬、分子伴侣介导自噬(chaperon-assisted autophagy，CASA)和RNA自噬等。本文中所指自噬为巨自噬，以形成双层膜自噬体为特征[11]。随着对自噬研究的不断深入，研究者发现自噬对降解底物具有高度选择性，除非选择性自噬外，自噬可特异性作用于多种细胞器和细胞质成分，如线粒体、核糖体及错误折叠的蛋白等[12]。

1.2 自噬的调控

自噬信号通路的精细调控在细胞应对不同的环境变化时起重要作用。自噬相关基因(autophagy-related gene，Atg)的编码蛋白参与自噬诱导、起始、延伸、自噬体形成及与溶酶体融合的全部步骤[13]。此外，自噬的分子机制复杂，可与其他相关信号通路发生相互作用。例如当哺乳动物雷帕霉素受体(mammalian target of rapamycin，mTOR)被抑制时，其下游的ULK1(UNC51-like kinase，与酵母中的Atg1同源)可被激活，启动自噬[14]。再如，beclin-1(Atg6)可接受多种信号调节自噬通路。生理条件下，抗凋亡蛋白bcl-2或bcl-XL与beclin-1的结合能力强，通过负调控Vps34/PI3K-beclin-1复合体的形成，抑制了依赖beclin-1的自噬通路[15]。当自噬被诱导时，beclin-1发生蛋白磷酸化，与bcl-2或bcl-XL解离，进而启动自噬[16]。

自噬体膜的延长与闭合阶段涉及2类泛素样蛋白结合系统：(1)Atg12与Atg5通过E1、E2泛素样酶形成共价结合，进而与Atg16发生相互作用形成Atg12-Atg5-Atg16复合体。同时该复合体也为微管相关蛋白的轻链3(LC3/Atg9)与磷脂酰乙醇胺的共价结合提供了平台。(2)LC3蛋白被Atg4B切割后，产生定位于细胞质的LC3Ⅰ，LC3Ⅰ被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰加工脂化，产生LC3Ⅱ，并定位在自噬体[6,17]。LC3Ⅱ被认为是自噬的特异性标志物，因此也被广泛应用于自噬流水平的检测[18]。p62(sequestosome 1，SQSTM1)是一种重要的自噬接头蛋白，含有与LC3相互作用的结构域，可将泛素化底物带入自噬体内，最终在溶酶体内降解[19]。p62积累增多意味着自噬过程受到阻滞，所以p62蛋白水平常作为自噬流的检测指标之一[19]。

2 自噬与小梁网细胞

小梁网是位于前房角的角膜和巩膜之间的网状结构，主要由内皮样细胞包绕的小梁弹性蛋白、胶原蛋白及小梁网细胞组成[20]。小梁网细胞分化成熟后增生能力较低，因此有效清除细胞内的受损蛋白和错误折叠蛋白对小梁网细胞的生存非常关键[20]。小梁网细胞可通过诱导或抑制自噬应对不同压力刺激，从而维持细胞稳态。

2.1 自噬在氧化应激过程中对小梁网细胞的作用

小梁网组织对自噬及氧化应激的敏感度随着年龄的增加而升高。Pulliero等[27]收集了28例健康捐献者的新鲜小梁网组织，通过检测发现年龄大于60岁捐献者的p62蛋白水平低于40～59岁捐献者，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平及DNA氧化损伤水平增高，表明人小梁网组织中自噬与氧化应激水平均随年龄的增加呈升高趋势。此外，衰老相关β半乳糖苷酶(senescence-associated-beta-galactosidase，SA-β-Gal)随着年龄的增加在溶酶体中积累增多[28]。Porter等[23]发现在慢性氧化应激环境下，小梁网细胞中SA-β-Gal活化增多，而用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)可减少SA-β-Gal的活化，说明自噬参与调控SA-β-Gal的活性。以上研究结果表明，氧化应激造成的自噬受损可能是导致小梁网细胞随着年龄增长功能逐渐失调的因素之一，是重要的POAG发病机制。近来，Porter等[29]发现青光眼患者的小梁网细胞在慢性氧化应激环境下直接作用于mTOR磷酸化位点Thr389(pRPS6KB-T389)，其下游底物RPS6KB磷酸化水平显著提高，并且LC3Ⅱ及p62蛋白表达水平下降，说明青光眼患者小梁网中自噬活动被抑制，甚至被破坏。以上实验的结论虽然看似矛盾，实际可能互为补充性实验结果，氧化应激诱导的自噬可能是正常小梁网细胞中的一种早期保护性机制。随着长期的氧化应激反应，发生溶酶体碱化及自噬功能下降，最终导致小梁网细胞功能失调。

2.2 自噬在机械性刺激过程中对小梁网细胞的作用

小梁网细胞可以感知和适应眼压波动带来的机械性刺激，从而维护细胞功能及眼内环境稳态。自噬在小梁网细胞被拉伸后30 min即被激活，说明自噬可能是小梁网细胞受到机械刺激后诱发的生理反应，而不是由于细胞形态变化后产生的继发性反应[29]。机械拉伸小梁网细胞可激活mTOR通路，抑制自噬。由此推断，小梁网细胞中还存在另一种非mTOR通路依赖的自噬途径，可以抵消由于mTOR活化产生的抑制自噬作用[30]。Shim等[31]进一步研究发现初级纤毛可作为循环机械拉伸诱导自噬的机械感受器，主要通过AKT1及非经典SMAD2/3信号通路相互作用参与调节自噬。CASA是一种选择性自噬，其中CASA复合物由HSC7、HSPB8和BAG3组成。研究发现，静态双轴拉伸不能激活CASA[30]，而在循环机械拉伸(伸长20%，1个循环/s)的环境中CASA被激活[32]。此外，BAG3参与了经典自噬和非经典自噬，这说明机械刺激诱导可能同时诱导发生了经典和非经典自噬[33]。

机械压力诱导发生自噬在病理生理学方面的意义尚不清楚。自噬可能通过增加蛋白质和细胞器通量，同时影响其他代谢过程，共同维持细胞和组织功能，帮助小梁网细胞及小梁组织应对机械压力[33]。自噬通常被当作一种保护性机制，然而，当机械压力超过正常眼压波动范围，造成病理性高眼压环境，则会导致自噬功能失调，造成细胞凋亡，甚至发生自噬性细胞死亡[24]。此外，有研究发现CASA有补偿性降压功能，但持续激活CASA可能造成小梁网细胞硬度增加，影响房水回流[34-36]。

3 自噬与视神经

RGCs是视网膜上唯一的投射神经元，其轴突构成视神经，视网膜产生的视觉信息经视神经传送至大脑。眼压升高、视神经区域血流灌注减少等病理变化均会导致RGCs凋亡及其轴突慢性退化，最终造成不可逆的视野缺损及视力下降。近年来，青光眼中自噬与RGCs胞体及其轴突的关系也受到广泛关注。

3.1 自噬在高眼压环境下对RGCs的作用

缺血-再灌注动物模型可以模拟前房急性眼压升高。Piras等[37]和Produit-Zengaffinen等[38]在缺血-再灌注动物模型中发现，抑制自噬对RGCs有保护作用。Russo等[39]在实验中发现视网膜急性缺血-再灌注引起的自噬反应是双相的。视网膜缺血损伤后可诱导自噬水平升高，这一现象可持续至再灌注后1 h，之后自噬水平逐渐下降。通过雷帕霉素增加自噬水平可减少RGCs死亡。Lee等[40]通过角膜缘缝线建立大鼠高眼压模型，并在实验中发现不同时间点自噬活性不同，早期自噬受损，1～4周自噬通量增加。同时，早期在玻璃体腔内注射雷帕霉素可提高RGCs存活率。在慢性眼压升高时，自噬在轴突和胞体内扮演的角色不同。Park等[41]在大鼠中通过灼烧巩膜上静脉建立慢性高眼压模型，结果发现LC3Ⅱ及自噬体在造模后1～4周逐渐增多，并且RGCs轴突先于胞体出现自噬现象。通过玻璃体腔内注射3-MA可使RGCs凋亡显著减少[42]。与之相反，Kitaoka等[43]在大鼠小梁区域行激光手术使眼压慢性升高，结果发现使用雷帕霉素可以显著减少眼压升高所致的轴突变性，而3-MA则加重了轴突变性。由于二者所用实验模型不同，上述结论还有待进一步研究证明。因此，自噬在RGCs死亡中的作用尚无统一的观点。值得注意的是，青光眼的发生和发展不仅与眼压升高相关，还与RGCs内在分子水平的变化有关。

3.2 自噬在RGCs轴突损伤后对RGCs的作用

RGCs轴突损伤可导致其发生自噬和凋亡。Sternberg等[44]在切断新生大鼠RGCs轴突后24 h观察到RGCs自噬及凋亡。采用3-MA抑制自噬则进一步加重RGCs损伤，说明自噬可以延缓，甚至阻止细胞退化，是轴突损伤后RGCs的保护性反应。但由于该实验为体外实验，并不能完全反映自噬在体内的真实作用。Knöferle等[45]构建了视神经夹持型急性青光眼大鼠模型，通过简单的外科手术及特有的成像方法在活体大鼠中观察到RGCs变性轴突中自噬体增多，钙流增加。应用3-MA可将轴突开始变性的时间由原来的30 min延迟到90 min，其作用可持续至360 min，且该模型中自噬的发生是钙依赖性的。然而，由于该实验持续时间较短，所以未能观察到RGCs胞体中的自噬情况。Kim等[46]研究发现，LC3Ⅱ蛋白表达量在轴突损伤后第3天达峰值，同时相关Atg蛋白表达水平升高，并且自噬水平上调时间先于凋亡。由此推测，轴突损伤后自噬增强，且对RGCs起保护作用。

3.3 自噬在RGCs中与凋亡的关系

细胞自噬与凋亡之间的关系非常复杂。尽管二者有各自标志性的形态学和生化特征，但其调控和执行蛋白网络之间存在重叠以及相互作用。凋亡是青光眼RGCs损伤的主要病理形式[47]。在青光眼大鼠模型中，受损的RGCs里可出现自噬标志物LC3及凋亡标志物TUNEL染色双阳性的现象，即自噬与凋亡同时被激活[37,42]。进一步研究发现，自噬对凋亡有一定的调控作用，在青光眼中，自噬参与胶质细胞活化、氧化应激等环节所诱导的细胞凋亡，起到促进或抑制的作用。

自噬参与胶质细胞活化诱导的RGCs凋亡。视网膜包含3种类型的胶质细胞，即星形胶质细胞、小胶质细胞和Müller细胞。小胶质细胞活化会产生肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、NO等神经毒性介质，造成线粒体损伤，从而诱导神经元发生凋亡[48]。Su等[49]在慢性高眼压小鼠模型中发现，使用自噬诱导剂雷帕霉素可抑制小胶质细胞活化，并减少TNF-α和NO的产生，提示自噬可能通过阻止视网膜小胶质细胞活化抑制外源性细胞凋亡。此外，视网膜上的Müller细胞活化可导致RGCs发生谷氨酸摄取障碍，从而刺激N-甲基-D-天冬氨酸受体大量释放，使Ca2+内流增加，诱发钙依赖的细胞凋亡[50-51]。Piras等[37]研究发现，在慢性青光眼模型中3-MA可抑制Müller细胞活化，同时RGCs凋亡减少。上述研究结果提示自噬可能参与了胶质细胞活化诱导的RGCs凋亡。

自噬参与氧化应激诱导的RGCs凋亡。ROS可造成RGCs线粒体损伤。线粒体损伤后，一方面，其外膜发生赖氨酸63位连接的泛素化，诱导线粒体自噬；另一方面，线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C，引发细胞凋亡[52]。现有的研究认为线粒体自噬可能是自噬抑制凋亡的主要机制，其原因是线粒体损伤后更倾向于发生细胞凋亡，通过自噬清除功能受损的线粒体可降低凋亡的发生率[47]。Rodríguez-Muela等[53]切断小鼠视神经后观察到线粒体受损且ROS产生增多。体外实验中使用雷帕霉素诱导自噬，RGC-5线粒体跨膜电位保持不变，ROS产生减少，采用3-MA抑制自噬则效果相反。该研究表明自噬可能通过清除RGCs中的受损线粒体，减少细胞凋亡发生，从而对发生氧化应激的RGCs起到一定的保护作用。

3.4 自噬与遗传性视神经变性

由于基因突变导致青光眼发病的研究相对少见，现有的研究表明，该过程中常涉及自噬机制失调。常染色体显性视神经萎缩(autosomal dominant optic atrophy，ADOA)是常见的原发性遗传性视神经病变。视神经萎缩基因1(optic atrophy 1，OPA1)突变可导致ADOA。OPA1突变的小鼠主要表现为RGCs数量减少，同时在RGCs及其轴突中出现大量自噬体。此外，自噬体增多的时间早于线粒体损伤和轴突退化，这说明在ADOA发病早期自噬具有重要作用[54]。Sarzi等[55]在OPA1delTTAG突变的小鼠模型中也观察到了类似的现象。ADOA中自噬激活是否有利于RGCs及其机制均有待进一步研究。

OPTN基因编码optineurin/OPTN蛋白，OPTN基因突变与正常眼压性青光眼的发生有关。与野生型OPTN相比，突变型E50K和M98K可诱导更多的RGCs死亡。OPTN蛋白可作为受体直接与LC3结合参与自噬的调控[56]。目前对E50K-OPTN的研究较多，雷帕霉素可减少E50K突变导致的RGCs凋亡[57-58]。Liu等[59]通过生物信息学研究发现E50K-OPTN小鼠存在蛋白质合成失调、自噬-溶酶体通路功能障碍等问题。与E50K-OPTN不同，在M98K-OPTN相关实验中发现，敲除Atg5可减少RGCs凋亡[60]。二者导致RGCs凋亡的机制不同，这也反映了青光眼发病机制的复杂性。

4 自噬与青光眼的治疗

4.1 基因调控自噬保护RGCs

有相关研究报道在细胞中可通过调控Atg保护RGCs。Chalasani等[57]通过突变LC3与E50K-OPTN的结合位点，使E50K-OPTN不能参与自噬过程，结果发现RGC-5死亡减少。Sirohi等[60]发现在LC3与M98K-OPTN的结合位点突变后，得到了同样的结论。同时，敲除RGC-5中的Atg5也可减少由M98K-OPTN诱导的RGC-5死亡。在动物实验中也有研究发现，调控Atg可减少RGCs死亡。Rodríguez-Muela等[53]在Atg4B-/-及特异性敲除RGCsAtg5的小鼠中切断其视神经，实验组视神经切断小鼠较野生型视神经切断小鼠RGCs的存活率高。以上结果表明，干预Atg是一种保护RGCs的潜在治疗手段。

4.2 药物调控自噬保护RGCs

研究发现自噬诱导剂可延缓或减少RGCs损伤。(1)常用的自噬诱导剂雷帕霉素除能够直接作用于哺乳动物mTOR位点诱导自噬外，还能影响Akt信号通路，增加其磷酸化蛋白，有利于RGCs存活[39,49]。有报道发现雷帕霉素可以清除积累的E50K突变蛋白，可能有助于治疗E50K突变诱发的正常眼压性青光眼[56]。(2)褪黑素可通过抑制mTOR通路诱导自噬，减少外伤性视神经损伤中的RGCs凋亡，对神经元有保护作用[61]。(3)β肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔是临床一线抗青光眼降眼压药物。有研究显示，普萘洛尔亦可诱导自噬并减少RGCs凋亡[62]。(4)在大鼠青光眼模型中，玻璃体腔内注射别孕烷醇酮或雷帕霉素均可通过提高自噬水平减少RGCs凋亡[63]。

另一方面，抑制自噬在一定程度上也可以减少RGCs凋亡。自噬抑制剂3-MA是一种PI3K蛋白的选择性抑制剂，PI3K蛋白与beclin-1结合召集自噬泡形成所需的吞噬泡膜。研究发现3-MA有阻断凋亡信号通路的作用，因此推测3-MA可能通过阻止早期自噬来减少RGCs凋亡[64]。

综上所述，自噬与青光眼的发生和发展密切相关。自噬在青光眼发病机制中的复杂作用与多种因素有关，仍不能得出系统性的结论。目前，自噬调控RGCs凋亡的具体分子机制、调控自噬是否会影响其他视网膜细胞存活、小分子自噬抑制剂或诱导剂的最佳治疗时间等问题仍有待进一步研究阐明。因此，如何通过调控自噬减少青光眼视神经损伤仍需进一步研究探索，加强对自噬在青光眼发病机制中的认识为临床治疗青光眼提供了新的思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突