于 洋， 马成瑶， 黄 东， 张彦龙， 曾伟民

（1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500；2.黑龙江大学 生命科学学院，哈尔滨150080）

0 引 言

黑木耳又称胶耳或树耳，是担子菌中非常珍贵的一种胶体真菌［1］，是中国以及一些亚洲国家最欢迎的食用菌，具有极高的营养价值［2］。黑木耳中含有很多如多糖、黑色素和腺苷等丰富的活性成分，对于黑木耳中含有的大多数活性成分的特性已有很多报道［3-4］，但对黑木耳凝集素以及相关特性却很少有报道。食用菌凝集素是一类普遍存在于真菌中的非免疫来源的糖蛋白或者蛋白质［5］。食用菌凝集素能够通过促进脾脏细胞和淋巴细胞的增生，诱导人和动物体内的巨噬细胞分泌多种细胞因子，从而提高机体的免疫力以达到抗肿瘤和抗癌的效果［6］。迄今为止，国内对动植物凝集素的免疫作用已经进行了广泛研究［7］，而对于食用菌凝集素的免疫调节作用的研究还处于发展阶段。研究表明，从灵芝菌丝体中分离的凝集素不仅对人的淋巴具有免疫抑制作用，还可以抑制幼雌鼠的自身免疫糖尿病，延长鼠类移植皮肤以及脾脏细胞的存活期［7］。草菇凝集素对乳腺瘤细胞815有一定的抑制作用，并且可以延长患病小鼠的寿命，是一种很好的免疫增强剂［8］。鸡腿菇凝集素可以增加T细胞数量，进而调节细胞免疫，提高机体抗肿瘤能力［9］。口蘑中分离的凝集素能够促进巨噬细胞的增殖和抑制白血病细胞的增殖等［10］。

巨噬细胞是一种来源于单核细胞的位于组织内的白血球，它是机体固有免疫系统的重要组成成分［11-12］，经常以不同形式存在于不同组织的免疫效应细胞中［13］。巨噬细胞既参与特异性免疫反应，同时又参与非特异性免疫反应，并且还是两者之间的桥梁。巨噬细胞可以分泌很多不同种类的细胞因子，能够有效地吞噬癌细胞和许多病原微生物［14］。巨噬细胞还具有递呈抗原的作用，可以将抗原进行加工处理并递呈给抗原特性T细胞和B细胞［15］。因此，本文选用RAW264.7鼠巨噬细胞作为研究对象，探讨黑木耳凝集素对RAW264.7鼠巨噬细胞的影响，以期为黑木耳凝集素在免疫方面的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳由勃利县食用菌研究所提供，-20℃保存。黑木耳凝集素由黑龙江大学生化药物分析实验室利用硫酸铵沉淀法粗提后，通过亲和层析法纯化得到，命名为LAA。RAW264.7鼠巨噬细胞委托哈尔滨海基生物公司购自中国科学院细胞库。

RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Cell Counting Kit-8购自北京碧云天生物技术研究所；脂多糖购自美国Sigma公司；中性红溶液购自北京碧云天生物技术研究所；吖啶橙购自北京碧云天生物技术研究所；乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自北京碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

3111型CO2培养箱（美国Thermo公司）；Imark型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；荧光酶标仪（北京原平皓生物技术有限公司）；Coulter Z2细胞计数仪（美国Bechman Coulter公司）；DP10型倒置显微镜（日本Olympus公司）；BCM-1000型生物净化工作台（上海玻璃仪器厂）；Biofuge 22R型高速冷冻离心机（德国Heraeus-Sepatech公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的培养和处理

选用胎牛血清浓度为10%的RPMI 1460培养基对RAW264.7细胞进行培养，于CO2浓度为5%、温度为37℃的湿润培养箱中进行传代培养。选取处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，加入1 mL 0.25%的胰酶处理3 min后，添加RPMI 1460培养基终止消化。重复轻柔吹打后，收集细胞，用PBS清洗3次，用细胞计数板进行计数。根据实验所需浓度进行铺板，以备后续实验。

1.3.2 细胞的形态观察

当RAW264.7细胞铺满瓶底面积约80%时，消化细胞，将细胞稀释至2×105个/孔，接种于96孔板内，37℃、5%CO2条件下培养过夜。黑木耳凝集素浓度分别设置为0、1、5、10、15、25、50、100μg·mL-1，阳性对照孔为1μg·mL-1的LPS，培养24 h。吸尽培养液，倒置显微镜镜检，拍照。

1.3.3 细胞毒性的检测

采用乳酸脱氢酶试剂盒来检测细胞的毒性，将对数生长期的巨噬细胞稀释至2×105个/孔后，接种于96孔板内，37℃、5%CO2条件下培养过夜。向试验孔及对照孔中加入不同浓度的黑木耳凝集素，在细胞培养箱内37℃、5%CO2条件下培养24 h。到达预定时间的前1 h，在对照孔中加入LDH释放液，混匀后继续培养，在96孔板内分别加入120μL待测培养液。加入LDH检测液60μL，避光30 min。用酶标仪检测OD值，每个样品重复测三次，按照公式（1）计算细胞毒性（%）。

1.3.4 细胞增殖活性的检测

选择CCK-8法来检测细胞的增殖活性［16］，试验设置调零孔只加培养基，96孔板的四周加无菌水。当RAW264.7细胞铺满80%瓶底面积时，消化细胞，将细胞稀释至2×105个/孔，37℃、5%CO2条件下培养过夜。向试验孔加入不同浓度的黑木耳凝集素，向对照孔加入1μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2条件下培养24 h。分别加入CCK-8溶液10μL，孵育2 h。用酶标仪检测OD值，每个样品重复测三次，按照公式（2）计算细胞存活率。

1.3.5 细胞核酸变化的检测

采用吖啶橙荧光染色法检测细胞的核酸变化［17］，当RAW264.7细胞铺满80%瓶底面积时，消化细胞，将细胞稀释至2×105个/孔后，37℃、5%CO2条件下培养过夜。试验孔加入不同浓度的黑木耳凝集素，对照孔加入1μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2条件下培养24 h。然后，除去含药培养基，用无菌PBS清洗2～3次。每个处理孔内加入无菌4%多聚甲醛，处理15～20 min。除去4%多聚甲醛，用PBS清洗2～3次，每次6 min。每个处理孔内加入预先配制好的无菌0.01%吖啶橙溶液，处理10 min后，用PBS清洗2～3次，每次6 min。核酸荧光强度用荧光酶标仪检测，每个样品重复测三次。

1.3.6 细胞吞噬能力的检测

采用中性红检测法检测细胞的吞噬能力，试验设置调零孔只加培养基，96孔板的四周加无菌水。当RAW264.7细胞铺满80%瓶底面积时，消化细胞，将细胞稀释至2×105个/孔后，37℃、5%CO2条件下培养过夜。向试验孔加入不同浓度的黑木耳凝集素，对照孔加入1μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2条件下培养24 h。每孔分别加入100μL无菌中性红溶液，继续培养2 h，弃上清液，用无菌PBS清洗2～3次。每孔加入200μL细胞裂解液，37℃温育3 h。用酶标仪检测OD值，每个样品重复测三次，按公式（3）计算中性红吞噬率。

1.4 数据统计分析

采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），各组间采用LSD法进行多重比较检验，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 RAW264.7鼠巨噬细胞的形态变化

图1为在倒置显微镜放大200倍的状态下观察的RAW264.7鼠巨噬细胞的形态变化。结果显示，图1（a）未加药处理组（阴性对照）的细胞形态为圆形、光亮。加入1μg·mL-1LPS（脂多糖）的处理组（阳性对照）细胞出现了典型的活化后特征，即细胞体积增大，细胞形态变为多边形或长梭形，如图1（b）所示。用不同浓度黑木耳凝集素LAA处理RAW264.7细胞，与阳性对照组相比，细胞形态发生改变，出现了活化特征，如图1（c）～1（i）所示。说明LAA可以活化RAW264.7巨噬细胞。

图1 RAW264.7鼠巨噬细胞的形态变化Fig.1 Morphological changes of RAW264.7 cells

2.2 LAA对RAW264.7鼠巨噬细胞毒性的影响

细胞坏死引起的细胞膜结构性破坏，会使细胞内稳定的乳酸脱氢酶（LDH）释放出来。所以通过检测LDH的含量，可以确定LAA对RAW264.7细胞的毒性影响。根据这个原理设计乳酸脱氢酶实验，结果如图2所示。可以看出，随着LAA浓度的增加，LDH分泌量也逐渐增多，但是与空白对照组相比，没有显著性差异，表明LAA在100μg·mL-1内对RAW264.7鼠巨噬细胞无毒性影响。

图2 不同质量浓度的LAA对RAW264.7细胞的毒性检测Fig.2 Toxicity test of RAW264.7 cells by LAA with different mass concentrations

2.3 LAA对RAW264.7鼠巨噬细胞增殖的影响

图3为不同质量浓度的LAA对RAW264.7细胞增殖的影响。可以看出，阳性对照组的细胞活性明显地增强（P＜0.01），LAA为1μg·mL-1时，可以促进凝集素的增殖。LAA为5～10μg·mL-1，以浓度依赖性极显著促进RAW264.7细胞的增殖活性。当LAA质量浓度为10～100μg·mL-1时，虽然增加的存活率开始下降，但与对照组相比仍有显著性增加。结果显示，LAA可以增强RAW264.7细胞活性（P＜0.01）。

图3 不同质量浓度的LAA对RAW264.7细胞增殖的影响Fig.3 Effect of LAA with different mass concentrations on cell proliferationt of RAW264.7

2.4 LAA对RAW264.7鼠巨噬细胞核酸代谢活性的影响

图4为不同质量浓度的LAA对RAW264.7鼠巨噬细胞核酸代谢活性的影响。可以看出，阳性对照组LPS可以明显增强RAW264.7细胞核酸荧光强度的相对比例。相对于空白对照组来说，通过LAA处理的RAW264.7鼠巨噬细胞的核酸荧光强度相对比例都有显著性增强（P＜0.01）。LAA质量浓度为1～10μg·mL-1时，随着质量浓度的增加，核酸荧光强度相对比例呈现增强的趋势（P＜0.01），甚至最高可以达到阳性对照组的效果。LAA质量浓度为15～100μg·mL-1时，核酸荧光强度相对比例增强的显著性（P＜0.05）效果降低，但相对于空白对照组仍有增强作用。结果显示，LAA可以增强RAW264.7鼠巨噬细胞核酸荧光强度的相对比例。

图4 不同质量浓度的LAA对RAW264.7细胞核酸代谢的影响Fig.4 Effect of LAA with different mass concentrations on nucleic acid metabolism of RAW264.7 cells

2.5 LAA对RAW264.7鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

LPS（脂多糖）能够诱导巨噬细胞分化成熟，是巨噬细胞的活化剂。中性红吞噬的实验结果如图5所示，可以看出，LPS刺激RAW264.7鼠巨噬细胞后，其吞噬能力（P＜0.05）明显提高。LAA刺激RAW264.7细胞后，与空白组相比，LAA质量浓度为1μg·mL-1时，可以促进RAW264.7细胞的吞噬能力。LAA质量浓度为5～10μg·mL-1时，以浓度依赖性极显著促进RAW264.7细胞的吞噬能力（P＜0.01）。LAA质量浓度为15～100μg·mL-1时，提高吞噬能力效果逐渐开始下降，但与对照组相比也有显著增强（P＜0.05）。表明LAA可以增强巨噬细胞的吞噬能力。

图5 不同质量浓度的LAA对RAW264.7细胞吞噬作用影响Fig.5 Effect of LAA with different mass concentrations on phagocytosis of RAW264.7 cells

3 讨 论

食用菌不仅有食用价值，而且具有很珍贵的药用价值。它不仅富含黑色素、氨基酸和许多微量元素，还含有多糖以及凝集素等药用成分。近年来，随着对真菌药理学研究的深入，食用菌凝集素逐渐成为了研究的热点［18］。而黑木耳作为营养价值极高的食用菌，有关黑木耳凝集素的研究却很少［19］。本文选用免疫学最常用的RAW264.7鼠巨噬细胞作为研究对象，对黑木耳凝集素的免疫作用进行了研究。实验以LPS作为阳性对照组，LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，在动物实验中经常诱导炎症的发生。本实验显示，加入LPS的RAW264.7细胞形态为圆形、光亮，LPS可以活化巨噬细胞，加入不同浓度的凝集素后，细胞形态发生了改变，出现了活化特征。说明黑木耳凝集素LAA可以促进RAW264.7细胞的增殖，为进一步研究黑木耳凝集素LAA的免疫活性作用奠定了基础。

LAA可以活化RAW264.7巨噬细胞。一些真菌活性物质在一些免疫学研究中会引起毒性的发生，本实验对不同浓度LAA处理的RAW264.7进行了检测，结果表明LAA处理的RAW264.7无毒性增长。巨噬细胞的活性增强有利于机体的特异性免疫，改善机体的免疫功能［20］。实验结果显示，黑木耳凝集素LAA可以促进RAW264.7细胞的增殖，为进一步研究黑木耳凝集素LAA的免疫活性作用奠定基础。核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的组成物质，核酸代谢活性的增强可以加强免疫［21］。通过吖啶橙荧光染色法检测到加入不同浓度的LAA时，核酸荧光强度相对比例有明显的增强，说明LAA可以通过促进核酸代谢活性来加强免疫能力。巨噬细胞是抵抗病原菌的重要防线，当病原微生物侵入时，会识别抗原的受体，使自身活化，进而增强吞噬能力并且清除病原体［22］。实验结果显示，LAA能够显著增强巨噬细胞的吞噬活性，增强巨噬细胞吞噬病原体的能力。

此外，活化的巨噬细胞可以分泌多种细胞因子。细胞外信号通过细胞表面受体传导到细胞内，细胞内的GTP酶和其他蛋白酶作用可以激活MAPKKK，而MAPKK可以被MAPKKK激活，激活后的MAPKK可以激活MAPK信号转导通路。胞浆内存在大量未被激活的ERK，当ERK激活后会转移至细胞核内，调节转录因子AP-1的活化，从而促进炎症因子基因的转录和翻译，促进炎症因子产生，IL-1β、IL-6、TNF-α都是由活化的巨噬细胞分泌的重要的促炎症因子。黑木耳凝集素可以活化巨噬细胞，活化的巨噬细胞可以直接杀死病原微生物，清除凋亡细胞和突变细胞，并可能通过分泌免疫活性分子参与并调控特异性免疫应答和天然免疫防御。

4 结 论

LAA可以刺激RAW264.7鼠巨噬细胞形态发生改变，使其出现活化特征，并且对细胞无毒性影响。它可以增加RAW264.7的存活率和核酸代谢活性，能够显著增强RAW264.7鼠巨噬细胞的吞噬能力，对巨噬细胞的活化有一定的影响。本结果为LAA在免疫学方面的研究提供了重要依据，并且拓展了黑木耳活性物质的合理利用范围。