王皓然， 李荣田， 马腾旭， 刘长华，3

（1.黑龙江大学 生命科学学院 黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，哈尔滨150080；2.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨150500；3.黑龙江大学 现代农业与生态环境学院，哈尔滨150080）

0 引 言

中国是世界上最大的水稻（Oryza sativa L.）生产国与消费国［1］。黑龙江省是我国最大的稻作区之一，所生产的稻米大部分进入国际及国内市场，寒区稻米以其绿色优质特征深受消费者青睐。黑龙江省第三积温区是黑龙江省的水稻主产区，该区域具有肥沃的土地资源、清洁的灌溉用水及漫长而寒冷的冬季，水稻病虫害少，稻米绿色指标高。但是，黑龙江省第三积温区冷凉的温度条件与水稻喜温性构成了基本的矛盾，水稻生产受障碍性冷害威胁较大。黑龙江省第三积温区水稻品种必须具有生育期合适及耐冷性强的特征［2］。水稻空育131耐冷性强、主茎叶片数11片左右、耐肥性中等、高产稳产，曾经是黑龙江省第三积温区的主栽水稻品种，也是粳稻年种植面积的纪录保持品种。空育131水稻生长量偏小、茎叶姿态直立程度差，限制了其产量的进一步提升。培育具有空育131水稻熟期、耐冷性及对肥力反应程度等基本特性的高产水稻新品种是十分必要的。水稻抽穗期（Heading date，Hd）是从出苗到抽穗所经历的天数，抽穗期的长短决定了水稻品种在不同区域的适应能力和产量［3］。Hd2基因，即PRR37/Ghd7.1/DTH7，Hd2是一个同时控制水稻每穗粒数、株高和抽穗期3个性状的主效QTL位点，定位在第7号染色体上［4］，也被称为HD2-L710P类型。依据Hd2和hd2在T2129C的SNP，Hd2具有XcmI酶切位点（5′-CCANNNNNNNNNTGG-3′），而hd2相应的序列（5′-CTANNNNNNNNNTGG-3′）失去了XcmI酶切位点，开发了Hd2-Caps标记［5-6］。Hd4基因，即Ghd7，是一个同时控制水稻每穗粒数、株高和抽穗期3个性状的主效QTL位点。依据Hd4和hd4在G157T的SNP类型，Hd4具有XhoI酶切位点（5′-CTCGAG-3′），而hd4相应的序列（5′-CTCTAG-3′）失去了XhoI酶切位点，开发了Hd4-Caps标记［7-8］。由以往研究可知，黑龙江省第一积温区晚熟品种大多数具有Hd2和Hd4基因，第三积温区早熟品种具有突变的hd2和hd4基因［9］。吉粳88是北方粳稻在育种水平上具有划时代意义的品种，具有株型直立、抗倒伏、生物量大、丰产和出米率高等优良性状，适于吉林省北部和黑龙江省南部地区种植［10］。推测吉粳88具有Hd2Hd2Hd4Hd4基因型。以空育131为父本，保留其早熟抽穗期基因（hd2hd2hd4hd4）及耐冷性强、对肥力的反应、高产稳产等基因及性状。同时，利用吉粳88株型直立、抗倒伏、生物量大和丰产等优良农艺性状，对空育131水稻的株型、株高和丰产性等性状进行遗传改良，培育适于黑龙江省第三积温区、在少施化肥条件下丰产的水稻新品种，有利于黑龙江省水稻主产区“资源节约、环境友好”生产类型的建设及推广。为此，配制了杂交组合吉粳88×空育131，对于杂交后代，在秧苗期利用功能性分子标记选择早熟抽穗期基因，在本田期利用目测观察选择株型、粒型、抗倒伏及耐冷性等农艺性状，培育适于黑龙江省第三积温区、耐冷、在减肥栽培条件下高产稳产的水稻新品种黑C173。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 水稻

吉粳88具有株型直立、抗倒伏、粒型圆粒及出米率高、高产等优良农艺性状，主茎叶片数15片叶左右，可以在吉林省北部和黑龙江省南部稻区栽培。

空育131耐冷性强、对肥力反应程度中等、高产稳产、主茎叶片数11片叶，适应于黑龙江省第三积温区种植。

以吉粳88为母本、空育131为父本配制杂交组合的各个分离世代，经过鉴定选择形成的稳定品系（包括黑C173）。

1.1.2 分子标记

用于鉴定基因位点Hd2（hd2）和Hd4（hd4）的功能性分子标记如表1所示。Hd2-Caps是基因位点Hd2（hd2）的功能性分子标记，Hd2位点期望条带84 bp，hd2位点期望条带101 bp；Hd4-Caps是基因位点Hd4（hd4）的功能性分子标记，Hd4位点期望条带84 bp，hd4位点期望条带104 bp［11］。

表1 鉴定水稻Hd2（hd2）和Hd4（hd4）基因位点的功能性分子标记Table 1 Functional molecular markers for Hd2（hd2）and Hd4（hd4）genes

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。实验中所用的化学试剂和分子生物学试剂均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻基因组DNA的提取和PCR及其产物的酶切标记

在水稻苗期采摘供试水稻叶片，依据CTAB法［12］提取水稻基因组DNA，将提取后的DNA存放于-20℃保存备用，具体实验方法如表2所示。利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对酶切的PCR产物进行检测。

表2 PCR及酶切反应体系Table 2 PCR and enzyme digestion reaction system

1.2.2 水稻黑C173的培育过程

黑C173的培育过程如图1所示，播种育苗阶段各项农事操作同一般生产田。本田阶段除了降低施用化肥水平外，其他生产措施与当地生产田相同，化肥施用水平为每667 m2施用纯N 6.5 kg，N∶P2O5∶1∶0.5∶1，比生产田施用化肥水平降低20%～30%。水稻新品系培育阶段的田间试验在黑龙江大学呼兰校区水稻试验基地和海南省三亚市南滨国农场黑龙江大学水稻南繁基地进行，水稻新品系鉴定阶段的田间试验在黑龙江省农垦总公司建三江分公司七星农场农业科技园区进行。

图1 培育水稻黑C173的工作流程Fig.1 Process of breeding for the rice HeiC173

1.2.3 吉粳88和空育131田间性状比较

在黑龙江大学呼兰校区水稻试验基地进行田间试验。吉粳88和空育131插秧栽培。试验设计为随机区选法，3次重复，小区为3行区，行长4 m，行距30 cm，株距12 cm，小区面积4.6 m2，单本插秧。抽穗期调查茎叶株型指标，株型指标包括株高、主茎剑叶与茎基角、主茎剑叶与茎张角、主茎剑叶与茎披垂角等性状。室内考种包括穗粒数、穗长、穗实粒数、千粒重、长宽比和稻谷的结实率。各田间性状每小区调查5株，以5株平均数代表小区值，以小区平均数进行方差分析和差异性比较。

1.2.4 候选品系田间性状的鉴定

高炉炼铁简易生产流程如图1所示。炉料经装料设备送入高炉中，热风由鼓风动力装置从高炉下部的风口鼓入炉内，炉料中的焦炭和热风中的氧气发生燃烧反应，产生大量高温还原性气体，将炉料加热并还原，期间有煤粉和焦炉煤气作为辅助还原剂输入高炉中。同时，铁水从出铁口放出，矿石中的脉石和熔剂结合形成炉渣，从渣口排出。产生过程中也会产生高炉煤气、余热、高炉灰等副产品。

水稻候选品系及其对照空育131种植在黑龙江省农垦总公司建三江分公司七星农场农业科技园区并进行田间性状鉴定，试验设为随机取组法，3次重复，小区为8行区，行长5 m，行距30 cm，株距12 cm，每穴插3棵苗，小区面积12.0 m2。水稻生长发育期间，每个小区按对角线定点5穴，每穴选择1个主茎标记叶位，直至孕穗期止。根据叶位结果即知主茎叶片数，5穴主茎叶片数平均值为小区的主茎叶片数。调查茎叶形态各指标同1.2.3。收获期每小区取5株进行室内考种，考种性状包括株高、穗数、穗粒数、穗实粒数、结实率、千粒重、粒长、粒宽和长宽比等，各性状5株平均数为小区的数值。收获期每小区按对角线选2点每点收割1 m2测产，稻谷用于室内分析精米率和食味值。食味值根据国家标准《粮油检验 稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法》（GB/T 15682-2008）进行评分。以小区平均数进行方差分析，t测验检验各候选品系与空育131的差异显著性。选择符合育种目标要求的水稻品系，即黑C173。

1.2.5 水稻黑C173耐冷性、稻瘟病抗性和抗倒性的鉴定

鉴定水稻黑C173的耐冷性、稻瘟病抗性和抗倒性，对照为空育131。

耐冷性鉴定：按照李霞等的方法［13］对黑C173及空育131水稻进行耐冷性鉴定。水稻盆栽，每个品种至少种10盆，每盆中单本插秧3株，水稻生长发育过程中每株保持3个茎蘖，待水稻发育到小孢子母细胞减数分裂期时，将5盆水稻置于温室，另5盆水稻置于人工气候箱之中进行低温胁迫。在15℃胁迫5 d后，将受胁迫过的水稻置于温室，直到水稻成熟。调查低温胁迫和常温条件下的水稻结实率，1盆为1个单位，重复5次。在本文中，品种耐冷性是以耐冷性结实率为指标，耐冷性结实率=常温条件下结实率-低温胁迫条件下结实率。差值大证明耐冷性弱，差值小证明耐冷性强。

倒伏指数鉴定：供试水稻种植在黑龙江省农垦总公司建三江分公司七星农场农业科技园区并进行大区示范。在水稻黑C173和空育131抽穗20 d左右时，根据文献［14］的方法调查水稻材料基部第2节间的弯曲力矩、抗折力及倒伏指数。弯曲力矩=基部第2节间底部至穗顶的长度（cm）×基部第2节间底部到穗顶鲜重（g）。抗折力测定，将带有叶鞘的基部第2节间两端横亘在两个支点上，保持水稻材料水平，在待测水稻节间中点处悬挂一个盘子，并向盘子中加入重物，直到水稻茎秆折断时为止，此时盘子及重物的合计重量就是该节间茎秆的抗折力。倒伏指数=弯曲力矩×抗折力×100。每个水稻材料测量5次倒伏指数，取其平均值代表抗倒伏性。

抗稻瘟病性鉴定：根据农业行业标准《水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程》（NY/T2646-2014）对水稻黑C173和空育131进行抗稻瘟病性鉴定。供试水稻种植于稻瘟病鉴定圃，多施氮肥，周边种植感病品种蒙古稻。田间实验设计采用随机取组法，3次重复，小区4行区，行长4 m，行距30 cm，株行12 m，每穴插3颗苗，小区面积4.8 m2。在水稻分蘖期和孕穗初期时接种当地混合稻瘟病菌，孢子浓度为2×105个·mL-1，每个小区调查水稻叶瘟及穗颈瘟级别。一个小区调查5株，5株平均值为小区数值。

2 结果与分析

2.1 培育水稻黑C173的选择体系

分子标记Hd2-Caps和Hd4-Caps对水稻空育131与吉粳88的PCR检测结果如图2所示。图2显示Hd2-Caps和Hd4-Caps在吉粳88和空育131水稻之间有明显的多态性，吉粳88具有Hd2Hd2Hd4Hd4基因型，空育131具有hd2hd2hd4hd4基因型。这表明，在吉粳88×空育131的后代中，可以利用Hd2-Caps和Hd4-Caps分子标记鉴定选择抽穗期基因位点Hd2（hd2）和Hd4（hd4）。

图2 水稻抽穗期基因Hd2（hd2）和Hd4（hd4）分子标记在吉粳88和空育131间的多态性Fig.2 Polymorphism of Hd2（hd2）and Hd4（hd4）of rice heading date genes between Jijing88 and Kongyu131

2.1.2 田间观察选择体系

水稻吉粳88和空育131田间性状表现如表3所示。由表3可知，空育131和吉粳88水稻之间在株高、主茎剑叶与茎基角、主茎剑叶与茎张角、穗粒数、穗长、穗实粒数、千粒重和结实率等性状存在着极显著差异。与吉粳88相比较，空育131株高较矮，茎叶直立性差，穗子偏小，结实性好。通过杂交育种措施保留空育131的早熟、耐冷和结实好等优良基因及性状的同时，引进吉粳88茎叶直立和生长量大等特征，培育适应于黑龙江省第三积温区的早熟、耐冷、稳产及比空育131更加丰产的水稻品种。

表3 水稻吉粳88和空育131的田间性状差异Table 3 Difference of rice agconomic traits between Jijing88 and Kongyu131

2.2 水稻黑C173品系的培育

2.2.1 F1世代植株鉴定选择

吉粳88为母本、空育131为父本进行杂交得到F1代，利用分子标记Hd2-Caps对F1代植株进行鉴定。在10个F1代植株中，第2～9号植株的基因型为杂合带型，是真杂种；第1号和第10号植株表现为吉粳88带型，是伪杂种，予以剔除，如图3所示。收获真杂种种子形成F2世代。

图3 水稻吉粳88×空育131 F1代的植株Hd2（hd2）表型及基因型Fig.3 Phenotypes and genotypes in rice Hd2（hd2）genes of F1 plants of Jijing88×Kongyu131

2.2.2 自交世代植株的鉴定选择

F2世代。F2世代种子育苗，选择健壮的秧苗至少107株。分子检测水稻秧苗Hd2-Caps和Hd4-Caps基因型。按照具有hd2和hd4基因的原则进行选择，入选秧苗的基因型及数量如表4所示。入选秧苗移植到本田，田间按茎叶株型直立、结实好、株高高于空育131及生长健壮的原则初选及决选植株。F2世代决选的植株收获形成F3世代株系，对F3世代株系编号，如表4所示。

表4 培育黑C173水稻F2代的分子标记及田间性状的鉴定选择Table 4 Dentification and selection of F2 plants of HeiC173 with molecular markers and field agronomic traits

F3世代。入选的F3世代5个株系，以株系为单位育苗。分子标记Hd2-Caps和Hd4-Caps检测水稻秧苗基因型，每个株系检测17株。依据同时具有hd2和hd4基因的原则选择水稻秧苗，移植至本田，如表5所示。本田阶段田间肉眼观察农艺性状，依据耐冷性、茎叶直立、剑叶夹角小、株高较高及抗稻瘟病，并且Hd2（hd2）和Hd4（hd4）位点目标基因尽量纯合的原则，每个株系决选1株收获种子，获得F4世代。

表5 培育黑C173水稻F3世代株系的分子标记及田间性状的鉴定选择Table 5 Dentification and selection of F3 lines and plants of HeiC173 with molecular markers and field agronomic traits

F4世代。与F3世代工作类似，在F4世代各株系苗期检测水稻植株Hd2-Caps和Hd4-Caps基因型，每个株系检测17株。从被检测植株中选择同时具有hd2和hd4基因的植株移植到本田。本田阶段肉眼观测水稻植株耐冷、叶直立、剑叶夹角小和抗稻瘟病等农艺性状。依据hd2hd2和hd4hd4位点目标基因型纯合优先的原则，从分子鉴定入选并肉眼观测选择的群体中，每个株系选1株收获种子，形成F5世代，具体如表6所示。由表6可知，F4世代决选株的分子鉴定位点基因型为hd2hd2hd4hd4。

表6 培育黑C173水稻F4世代株系的分子标记及田间性状的鉴定选择Table 6 Dentification and selection of F4 lines and plants of HeiC173 with molecular markers and field agronomic traits

F5世代。F5世代秧苗期各株系随机选择5株提取DNA，将株系内各株DNA等量混合形成混合DNA，以株系混合DNA为模板PCR检测Hd2-Caps和Hd4-Caps的表型及基因型，如图4所示。图4显示F5世代5个株系均为hd2hd2hd4hd4纯系。F5世代每个株系本田插秧17株，形成株行。本田阶段肉眼观测水稻株行及植株，选择耐冷、叶直立、株高较高、剑叶夹角小、抗稻瘟病的株系及植株，每个株系选1株收获种子，形成F6世代。

图4 分子检测水稻吉粳88×空育131 F5世代株系Hd2（hd2）和Hd4（hd4）基因型Fig.4 Genotypes of Hd2（hd2）and Hd4（hd4）of F5 lines and plants of Jijing88×Kongyu131 with the molecular markers

F6及其以后世代。F6世代株系为单位育苗移栽，本田阶段每个株系不少于17株。本田阶段田间选择耐冷、叶直立、茎叶夹角小、株高较高及抗稻瘟病植株，每个株系决选1株，收获种子形成F7世代株系。F7及以后世代重复F6世代工作，直至形成稳定一致的株系世代为止。收获稳定的株系，形成黑C173候选品系，即品系-1、品系-2、品系-3、品系-4和品系-5。

2.3 黑C173候选品系田间表现

水稻黑C173候选品系田间表现如表7所示。由表7可知，与空育131比较，水稻黑C173各候选品系的主茎叶片数、结实率、精米率和食味值等未见显著差异；株高变高、茎叶姿态直立、穗粒数增多、穗子变大、丰产性极显著地提高。其中，候选品系-1各性状综合表现最好，选择品系-1并命名为黑C173。

表7 水稻黑C173候选品系田间性状表现Table 7 Field characteristics of candidate lines of rice HeiC173

2.4 水稻黑C173的耐冷性、抗倒伏性和抗稻瘟病性

水稻黑C173的耐冷性、抗倒伏性和抗稻瘟病性的鉴定结果如图5所示。由图5可知，空育131和黑C173低温胁迫后的结实率下降幅度未见显著差异，空育131抗倒伏指数显著高于黑C173，空育131叶瘟及穗颈瘟发病级显著高于黑C173，说明黑C173比空育131的抗倒伏性及抗稻瘟病性增强，耐冷性与空育131类似。黑C173有可能在黑龙江省第三积温区推广应用。

图5 水稻黑C173的耐冷性、抗稻瘟病和抗倒伏性Fig.5 Cold tolerance，blast resistance and lodging resistance of rice HeiC173

3 讨 论

水稻Hd2（hd2）和Hd4（hd4）的基因位点是控制抽穗期的主效基因，利用功能性分子标记选择Hd2（hd2）和Hd4（hd4）基因是有效的。周文甲等（2017）以黑龙江省第二积温区水稻品种“绥粳14”为材料，利用CRISPR×Cas9技术对抽穗期基因Hd2进行基因编辑，使Hd2基因突变为hd2，创造了早熟香味水稻绥粳14-d1和绥粳14-d2［15］。薛为亚等以汕优63（珍汕97×明恢63）衍生的F2群体为材料研究杂种优势的遗传基础时发现，Hd4基因的自然变异是调控水稻抽穗期和产量潜力的重要因素［16］。本文利用功能性分子标记选择hd2和hd4基因，培育出了水稻黑C173。水稻黑C173具有hd2hd2hd4hd4基因型，植株主茎叶片数11片左右，比吉粳88少3片以上，适用于在黑龙江省第三积温区种植。

株型、株高、抗倒伏和耐冷等性状是水稻重要的农艺性状，遗传基础复杂，目前利用分子标记进行这些重要农艺性状的鉴定选择尚有难度。田间目测观察选择茎叶姿态、株高、成熟期茎秆基部耐压能力及分蘖穗和弱势颖花的结实性等特征是可行及有效的。张洪熙等利用田间选择方法在长江中下游稻区培育成功了籼型水稻理想株型材料。韩思迪等依据田间目测观察结合分子标记检测，选择了水稻T135的理想株高性状［17］。王笑见等利用分子标记结合田间农艺性状鉴定选择，创建了一批抗倒伏、抗稻瘟病或褐飞虱的恢复系［18］。本文利用田间目测观察选择株型、株高、抗倒伏和耐冷等性状，培育出了株型直立、株高较高、抗倒伏和耐冷的水稻品种黑C173。

利用分子标记与田间观察相结合鉴定选择育种材料，是创制水稻新种质和培育水稻新品种的有效方法。裘烨等利用分子标记辅助选择技术选择抗稻瘟病基因，同时，田间进行农艺性状的鉴定选择，获得了抗病、农艺性状优良的水稻恢复系［19］。刘之熙等利用dCAPS标记结合目测观察水稻田间的结实情况，选择到水稻孕穗期耐冷基因S13316A［20］。dCAPS功能性分子标记技术结合田间选择已经在番茄、大麦、大豆和水稻等植物中广泛应用［21-22］。本文在秧苗阶段利用功能性分子标记Hd2-Caps和Hd4-Caps等对水稻基因位点Hd2（hd2）和Hd4（hd4）进行了有效的选择，缩小了本田阶段育种材料群体，为本田阶段准确鉴定水稻株型、株高、抗倒伏及耐冷性等农艺性状提供了前提。分子标记与田间观察相结合培育的水稻黑C173适于在黑龙江省第三积温区种植，具有抽穗期早、茎叶直立、株高较高、抗倒伏、耐冷和丰产等目标性状。

4 结 论

Hd2（hd2）和Hd4（hd4）位点是决定黑龙江省水稻抽穗期的主效基因，Hd2-Caps和Hd4-Caps标记可以有效地鉴定选择Hd2（hd2）和Hd4（hd4）基因。结合田间目测观察茎叶姿态、株高以及以手触摸茎秆基部判断耐压能力强弱等，来选择株型、株高、抗倒伏等农艺性状是可行及有效的。在水稻秧苗阶段，利用功能性分子标记选择目标基因及性状，缩小了本田阶段育种材料规模，保证了田间目测观察农艺性状的准确性。利用分子标记和田间农艺性状选择相结合的方法，培育出的黑C173水稻品种具有hd2hd2hd4hd4基因型及早熟、茎叶直立、抗倒伏、丰产、出米率高和耐冷性好等特性，可以用于黑龙江第三积温区优良稻米生产。