董德明，翟 敏，廖廷彦

湖北省枣阳市第一人民医院儿科，湖北枣阳 441200

疱疹性咽峡炎常发生在幼儿时期，是一种急性上呼吸道感染性疾病，主要由肠道病毒感染所致，具有传染性[1]。该病多发于夏秋季，临床症状有高热、咽痛、流涎、厌食等，患儿咽峡部及软腭可见疱疹，并伴有多发性口腔溃疡[2]。疱疹性咽峡炎常见于1～7岁儿童，可引发心肌炎、脑炎，严重威胁儿童的健康。肠道病毒感染可改变机体体液免疫，致使T淋巴细胞的数量和功能发生改变[3]。微小RNA(miRNA)能在机体炎症相关通路中发挥作用，调节炎性反应。miR-21参与多种肿瘤和自身免疫疾病的发生、发展[4]。研究表明，miR-21过表达可抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6的表达，并上调IL-10水平，抑制炎性反应[5]。miR-21在疱疹性咽峡炎中的表达及对炎性反应的影响报道较少。辅助性T淋巴细胞(Th)17和调节性T淋巴细胞(Treg)是一对具有拮抗作用的T淋巴细胞亚群，参与维持机体免疫平衡，二者比例失衡与多种炎症性疾病和自身免疫疾病的发病有关[6]。Th17/Treg平衡在疾病中所起的作用已被大量报道，但在疱疹性咽峡炎中的作用少有报道。本研究检测了疱疹性咽峡炎患儿血清中miR-21水平及Th17/Treg平衡的变化，旨在探讨二者的关系及在疱疹性咽峡炎进展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年11月至2020年4月在本院就诊的68例疱疹性咽峡炎患儿作为试验组；选取同期在本院体检的63例健康儿童作为对照组。试验组年龄1～6岁，平均(3.59±1.18)岁；男36例，女32例；平均体质量指数(20.16±1.39)kg/m2；散居27例，幼托41例；平均心率(109.37±12.86)次/分；平均舒张压(61.48±10.21)mm Hg，平均收缩压(99.35±11.18)mm Hg。对照组年龄1～6岁，平均(3.82±1.36)岁；男32例，女31例；平均体质量指数(20.35±1.42)kg/m2；散居28例，幼托35例；平均心率(105.43±12.57)次/分；平均舒张压(63.15±9.62)mm Hg，平均收缩压(101.54±11.74)mm Hg。2组受试儿童年龄、性别、体质量指数、是否幼托、心率、舒张压和收缩压比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，所有受试儿童家属均签署知情同意书。

纳入标准：(1)符合《诸福棠实用儿科学》疱疹性咽峡炎诊断标准[7]；(2)发病3 d内就诊；(3)就诊前两周未使用激素或免疫调节剂；(4)7岁以下儿童。排除标准：(1)先天性心脏病者；(2)合并肝脏、肾脏、肺部疾病者；(3)先天性免疫缺陷者。

1.2仪器与试剂 Trizol试剂(批号VB459280)购自上海一基实业有限公司；反转录试剂盒(批号KL266)购自上海康朗生物技术有限公司；实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒(批号KK4662)购自美国Kapa Biosystems公司；人转化生长因子-β1(TGF-β1)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(批号EK0513)购自美国Sciencell公司；IL-17 ELISA试剂盒(批号AE0176M/S)、IL-2 ELISA试剂盒(批号AE0054M/S)、IL-6 ELISA试剂盒(批号AE0048M/S)和IL-10 ELISA试剂盒(批号AE0064M/S)均购自南京善本生物科技有限公司；qPCR仪(型号100133)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；流式细胞仪(型号Gallios)购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3方法

1.3.1样品采集 抽取2组受试儿童的空腹外周静脉血8 mL，其中3 mL外周血加入乙二胺四乙酸抗凝，用于制备外周血单个核细胞(PBMC)；另外5 mL以4 000 r/min离心5 min，吸取上层血清，-20 ℃保存。

1.3.2qPCR测定血清中miR-21相对表达水平 于-20 ℃冰箱中取出血清标本，按Trizol试剂说明书提取总RNA；按反转录试剂盒说明书制备cDNA。qPCR反应体系(20 μL)：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，H2O 6μL，每个标本设置3个复孔。根据目的基因设计相应引物，以U6为内参，序列见表1。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40个循环。根据各标本平均循环阈值(Ct)值，采用2-ΔΔCt法计算miR-21相对表达水平。

表1 miR-21及内参基因U6引物序列

1.3.3Th17、Treg的检测 将采集的抗凝外周血采用密度梯度离心法提取PBMC，所得PBMC重悬至1×106个/mL，向重悬好的细胞中加入离子霉素1 μg/mL、佛波酯 50 ng/mL，在含高尔基蛋白转换抑制剂的1640培养基中培养5 h。250×g离心5 min，将细胞进行固定、染色、透明化处理，其中Th17采用IL-17染色(IL-17阳性细胞为Th17)，Treg细胞采用Foxp3染色(Foxp3阳性细胞为Treg)。染色后，采用流式细胞仪检测Th17、Treg表达，计算Th17、Treg百分率及Th17/Treg。

1.3.4血清中相关炎症因子检测 采用双抗体夹心ELISA法检测血清中TGF-β1、IL-17、IL-2、IL-6和IL-10水平，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.12组miR-21相对表达水平比较 试验组miR-21的相对表达水平(0.95±0.36)高于对照组(0.49±0.13)，差异有统计学意义(t=9.578,P<0.05)。

2.22组Th17百分率、Treg百分率、Th17/Treg比较 试验组Th17百分率高于对照组，Treg百分率低于对照组，Th17/Treg高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组Th17百分率、Treg百分率、Th17/Treg比较

2.32组血清中相关炎症因子水平比较 试验组TGF-β1、IL-17和IL-6水平均高于对照组,IL-2和IL-10水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组血清中相关炎症因子水平比较

2.4血清中miR-21相对表达水平与疱疹性咽峡炎患儿Th17/Treg及炎症因子的相关性 疱疹性咽峡炎患儿血清中miR-21相对表达水平与Th17/Treg、TGF-β1、IL-17及IL-6水平均呈正相关(P<0.05)，与IL-2及IL-10水平均呈负相关(P<0.05)。见表4。

表4 疱疹性咽峡炎患儿血清中miR-21相对表达水平与Th17/Treg及炎症因子的相关性

3 讨 论

疱疹性咽峡炎大多由柯萨奇A型病毒和肠道病毒71型感染所致，偶发于青少年和成人，多发于儿童，同一个患儿可被多次感染，常伴有吞咽困难、发烧、咳嗽、腹痛、呕吐等症状[8]。该病经呼吸道及粪口途径传播，也能通过手、衣、物等传播。病程一般为4～6 d，临床治疗常采用对症治疗为主、口腔局部抗病毒药物治疗为辅的方式，预后良好[9]。少数患儿会出现肺水肿、脑炎、无菌性脑膜炎、心肌炎等并发症，严重者可导致患儿死亡[10]。肠道病毒感染往往会引发机体炎性反应，导致多种炎症因子表达异常。

miRNA是长度为18～25个核苷酸的非编码小RNA，能够与靶基因mRNA 3′非翻译区结合，在转录后调控基因表达的过程中发挥重要作用[11]。miRNA参与人体多种生理活动，部分miRNA可参与调节炎性反应。miR-21在多种肿瘤中呈高表达，发挥致癌作用。研究发现，miR-21在结肠癌中相对表达水平升高，且与IL-6水平呈正相关，miR-21可能通过调节IL-6等炎症因子调控病程进展中的炎症状态[12]。研究表明，miR-21在强直性脊柱炎患者血清中呈高水平，炎症刺激miR-21相对表达水平升高[13]，与本研究结果相符。本研究发现，miR-21在疱疹性咽峡炎患儿血清中相对表达水平升高，提示miR-21可能参与疱疹性咽峡炎的发生、发展。CD4+T淋巴细胞在不同的微环境中分化为不同的T淋巴细胞亚群：Th1、Th2、Th17及Treg，在免疫应答中发挥不同作用[14]。Th1细胞参与细胞介导的免疫应答，Th2细胞可促进体液免疫，Th17主要发挥促炎作用，而Treg则可抑制炎性反应[15]。Th17/Treg失衡是多种免疫相关疾病发病的关键因素。本研究结果显示，疱疹性咽峡炎患儿血清中Th17百分率升高，Treg百分率降低，Th17/Treg升高，提示Th17、Treg参与疱疹性咽峡炎的炎性反应。

Th17能合成并分泌大量IL-17，已成为主要的致病性T淋巴细胞亚群，能产生多种细胞因子，通过多种效应机制介导炎性反应的发生[16]。Treg可抑制CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的分化及功能，维持自身免疫耐受，抑制过度炎性反应[17]。Th17与Treg相互关联，TGF-β1诱导Treg分化，在IL-6存在时则促进Th17分化[18]。有报道称，miR-21在固有免疫反应前期相对表达水平升高，可激活相关免疫应答，促进炎性反应，在中后期，miR-21相对表达水平降低，此时可抑制IL-6水平，上调IL-10水平，加快免疫稳态的恢复[19]。既往研究显示，miR-21可能通过Toll样受体途径，从而影响T淋巴细胞的功能和分化，参与机体的免疫应答过程[20]。本研究疱疹性咽峡炎患儿血清中TGF-β1、IL-17和IL-6水平均升高，IL-2和IL-10水平均降低，此外，miR-21相对表达水平与Th17/Treg、TGF-β1、IL-17及IL-6水平均呈正相关，与IL-2及IL-10水平均呈负相关，提示miR-21可能通过影响T淋巴细胞的分化及功能，从而影响IL-6、IL-10、IL-17等炎症因子，参与炎性反应。

综上所述，miR-21相对表达水平及Th17/Treg在疱疹性咽峡炎患儿血清中均升高，且二者呈正相关，提示miR-21可能通过影响患儿的炎性反应，从而影响疱疹性咽峡炎的疾病进展。但本研究样本量少，结果可能有局限性，尚需扩大样本量，对相关机制进行深入探讨。