王萌萌，熊 丹，汤花梅，张水兰，阚丽娟，豆小文，李 悦，宗曾艳，张秀明△

1.广东省深圳市罗湖区人民医院医学检验科，广东深圳 518001；2.安徽理工大学医学院，安徽淮南 232001

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)核酸检测系统是一种将PCR与MALDI-TOF MS检测系统相结合用于高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)分型诊断的新方法。该法由多重PCR反应、单碱基延伸和飞行时间质谱分析三步构成，可准确快速地实现多基因多位点检测[1]。本研究依据《人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》[2]、医学实验室检测系统性能评价的相关要求和参考文件，对MALDI-TOF MS 检测系统检测18种HR-HPV核酸的准确度、检测下限和抗交叉反应能力进行评价，并将其检测结果与Cobas4800和之江HR-HPV 2种实时荧光定量PCR(qPCR)检测系统进行一致性评价，以期为病原体核酸质谱检测性能验证提供重要参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年9-11月在深圳市罗湖区人民医院进行宫颈癌筛查的患者的宫颈脱落细胞标本，初筛选取347份宫颈脱落细胞标本，其中罗氏保存液收集标本180份，之江保存液收集标本167份，标本保存在-80 ℃冰箱。纳入标准：(1)剩余标本量>2 mL的标本；(2)收集的阳性标本需涵盖HPV16、18型及其他12种罗氏检测型别。排除标准：影响检测结果的标本，如红细胞水平过高的标本。

1.2仪器与试剂 Cobas x480全自动核酸提取仪、Cobas z480 qPCR仪及其配套试剂盒均购自美国罗氏公司；Autrax全自动核酸提取工作站及其配套试剂盒购自上海之江公司；Smart32半自动核酸提取仪、Applied Biosystems Veriti 384 qPCR扩增仪、Heraeus fresco 21离心机均购自美国Thermo Fisher Scientific公司； DR MassArray MALDI-TOF MS检测系统及HPV分型核酸检测试剂盒购自广州达瑞公司；SLAN-96S全自动qPCR仪购自上海宏石公司；Eppendorf移液枪购自德国Eppendorf公司；Vortex-Genie2 漩涡混合器购自美国Scientific Industries公司；Magen磁珠血液快速提取试剂盒购自广州美基公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取及扩增 所有标本检测和仪器操作均严格按照厂家说明书和相应仪器的标准作业程序进行。(1)MALDI-TOF MS检测系统：采用Magen磁珠血液快速提取试剂盒和Smart32半自动核酸提取仪提取HPV-DNA。核酸扩增使用Applied Biosystems Veriti 384 qPCR扩增仪，根据厂商试剂说明书设置相应反应程序，采用MALDI-TOF MS检测系统对扩增好的产物进行HPV分型检测。(2)之江检测系统：采用上海之江核酸提取试剂和扩增试剂在Autrax全自动核酸提取工作站进行HPV-DNA提取和加样，SLAN-96S全自动qPCR仪用于核酸扩增；(3)Cobas4800检测系统：使用Cobas4800核酸提取和扩增试剂在Cobas x480全自动核酸提取仪进行HPV-DNA提取和加样，核酸扩增在Cobas z480 qPCR仪上进行。

1.3.2准确度评价 采用MALDI-TOF MS检测系统对随机选取的40份宫颈脱落细胞标本的18种HR-HPV型别进行检测，将其检测结果与Sanger测序法结果进行比对，通过比较二者检测结果的一致性，分析MALDI-TOF MS检测结果的准确性。

1.3.3检测下限评价 取18种HPV型别重组质粒(购自广州达瑞诊断公司)，原浓度106copy/mL进行10倍梯度稀释，最终得到105、104、103、102、10 copy/mL，共5个浓度梯度，18种型别每个梯度重复检测10次。评价每个梯度各个型别的检出情况。根据《人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》[2]关于检测下限的标准，10次扩增结果检出的总阳性符合率为100.00%，则符合标准。

1.3.4精密度评价 依据《人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》[2]精密度评价标准，选取HPV16、18型2个型别的阳性参考品(每份参考品均稀释成104、102copy/mL 2个浓度梯度)和1份阴性参考品，分别代表强阳性、临界阳性和阴性标本进行质谱检测分析，每个型别每天检测2次，连续测定5 d。评价2个HPV型别检测的批间精密度；各型别同一批次检测10次，评价2个型别检测的批内精密度。

1.3.5抗交叉反应能力评价 将常见的HPV型别(如HPV6、11、40、42、43、44、54、61、67、69、70、71、72、81型和CP8304、83型)及种属相近或引起症状相似的其他病原体(如沙眼衣原体、解脲脲原体、单纯疱疹病毒2型、巨细胞病毒、梅毒螺旋体、淋球菌、白色念珠菌、阴道毛滴虫等)加入到10份HPV检测结果为阴性的标本内进行扩增，每个标本重复检测3次，评价外源性干扰物对质谱分析结果的影响。

1.3.6方法学比较 根据各厂商说明书对初筛选取的347份宫颈脱落细胞标本进行检测，记录3种方法的检测结果，比较3种检测结果的一致性。以Cobas4800检测系统的结果为参考，判断MALDI-TOF MS和之江检测系统的灵敏度、特异度。

1.4统计学处理 采用SPSS23.0统计软件进行数据处理分析。使用Kappa值比较3种检测方法的一致性[Kappa值大小所代表的一致性强弱分为6个区段：一致性弱(<0.00)，一致性微弱(0.00～0.20)，一致性弱(>0.20～0.40)，中度一致(>0.40～0.60)，高度一致(>0.60～0.80)及一致性极强(>0.80～1.00)]，95%CI用于估算Kappa值的二项分布[2-3]；使用Mcnemar检验计算P值，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13种HR-HPV检测方法比较 3种方法中，MALDI-TOF MS检测限最低，为100 copy/mL，之江检测系统检测限最高，为10 000 copy/mL。Cobas 4800检测系统能够检测14种HR-HPV型别但仅能对HPV16型和HPV18型进行分型；之江检测系统能对15种HR-HPV进行分型测定；MALDI-TOF MS检测系统可对18种HR-HPV进行分型测定。由于3种方法对HR-HPV的检测型别略有差异，以下仅对14种HR-HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)检测结果进行比较，且对16型和18型结果单独分析，其他12种型别进行合并分析。

2.2MALDI-TOF MS准确度评价 MALDI-TOF MS检测系统与Sanger测序法对40份宫颈脱落细胞标本的18种HR-HPV型别检测的准确度为100.00%，检测结果完全一致，具体检测型别见表1。

表1 MALDI-TOF MS准确度验证结果

2.3MALDI-TOF MS检测下限评价 使用18种HR-HPV重组质粒为模板，核酸质谱检测显示1～2个目标峰，代表特定HPV型别的扩增产物和未延伸引物，各个型别之间不产生交叉反应。18种HPV型别中HPV26、33、45和56型在103copy/mL的检出率为100.00%(10/10)，HPV16、18、31、35、39、51、52、53、58、59、66、68、73和82型在102copy/mL的检出率为100.00%(10/10)。结果显示18种型别的HPV检测下限均在102～103copy/mL。

2.4MALDI-TOF MS精密度评价 HPV16型和HPV18型2个型别在102copy/mL和104copy/mL的总检出率均为100.00%(20/20)，批内和批间精密度均为100.00%(10/10)；阴性参考品的检出率为0.00%，重复性为100.00%。表明该质谱检测系统性能稳定，满足HPV核酸的检测要求。

2.5MALDI-TOF MS抗交叉反应能力评价 10份阴性标本加入干扰病原体扩增后，MALDI-TOF MS检测结果仍为阴性，未出现特征峰，阴性符合率为100.00%(10/10)，表明该检测方法对非本试剂盒检测的病原体无交叉反应，具有良好的特异度。

2.6临床标本检测符合率 采用MALDI-TOF MS检测系统对347份标本检测的阳性率为62.54%(217/347)，之江检测系统阳性率为61.10%(212/347)，Cobas4800检测系统阳性率为64.27%(223/347)。3种方法检测的总符合率为92.51%(321/347)，其中有306份标本基因型检测完全一致(88.18%)。Cobas4800和之江检测结果的符合率最低，为92.22%(320/347)，Cobas4800与MALDI-TOF MS检测系统结果的符合率为94.81%(329/347)，之江和MALDI-TOF MS检测系统的符合率最高，为96.83%(336/347)。3种方法对HPV16型和HPV18型检测的总符合率为98.56%和97.12%，其中之江和MALDI-TOF MS检测系统对HPV16、18型的检测符合率高达98.85%(Kappa=0.965，95%CI0.932～0.993)和98.27%(Kappa=0.917，95%CI0.852～0.982)。见表2。

表2 临床标本检测结果(n)

2.7灵敏度和特异度评价 MALDI-TOF MS检测系统的灵敏度为94.62%，特异度为95.16%，均高于之江检测系统(灵敏度为91.48%，特异度为93.55%)。

3 讨 论

HR-HPV的持续感染与宫颈上皮病变密切相关，及时筛查HR-HPV分型是预防宫颈癌的重要手段。HPV16型与HPV18型不仅在世界范围内高发，也是发生宫颈癌风险程度最高的2种型别。有研究表明，其他型的HR-HPV感染与地域分布密切相关，例如在亚洲地区，HPV52、58型的感染率较高；而在南美等地区，HPV31型更为流行；此外HPV33、45型是非洲地区的高发感染型别[3-5]，因此对HR-HPV进行基因分型检测和地区流行性调查，对HR-HPV感染的风险程度判断、疫苗研发有重要作用。本研究中Cobas4800检测系统虽可一次性检测94份标本，但只能区分HPV16、18型具体分型，不能区分其他高危型别；之江检测系统虽能对15种HR-HPV型别进行全部分型但只能单次检测22份标本。以二代基因测序为代表的高通量测序技术，因其检测成本高、周期长、质控难、操作复杂、可重复性不高等因素限制了其在临床上的大规模应用[6]。新兴的MALDI-TOF MS检测系统填补了中通量HPV-DNA检测的空缺，又能实现准确、快速、经济的HPV-DNA多基因多位点检测[7]，本研究使用的MALDI-TOF MS HR-HPV检测系统可在10 h内实现单次检测192份标本，并对这些标本的18种HR-HPV准确分型。

对一个新的检测系统进行性能验证是保证检测质量的重要基础，本研究依据《人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》和相关研究报道[8-10]对MALDI-TOF MS检测系统进行了准确度、精密度、检测下限和抗交叉反应能力的性能验证。研究结果显示MALDI-TOF MS检测系统对于18种HR-HPV检测的准确度为100.00%，检测下限在102～103copy/mL，灵敏度较高。在抗交叉反应能力试验中，MALDI-TOF MS检测系统对非本试剂盒检出范围内的常见HPV型别与种属相近或引起症状相似的其他病原体无交叉反应，表明该法特异度较高，可满足临床和科研对HR-HPV的分型检测需求。

本研究挑选了347份临床标本对MALDI-TOF MS检测系统和2种常用的qPCR检测系统进行了比较。3种方法对347份临床标本检测的阳性率在61.10%～64.27%，其中Cobas4800检测系统的阳性率最高(64.27%)，之江检测系统阳性率最低(61.10%)，可能与检测限的设定有关。本研究标本的阳性率偏高，主要原因在于本研究对HPV标本的结果进行了初步筛选，选择了一定比例的HPV16、18型阳性结果的标本。在已测标本符合率的评价中，3种方法对于HPV16型检测符合率均高于HPV18型，并且结果显示3种HPV检测方法具有高度一致性，其中之江和MALDI-TOF MS检测系统对HR-HPV分型检测结果的符合率最高，Cobas4800和之江检测系统的符合率最低。目前，由于缺乏真正的HPV检测金标准，评估新的HPV检测方法的研究通常基于与已建立的试验方法的比较及与疾病终点的相关性评估[11-13]。Cobas4800 HPV检测是新开发的HPV检测试剂盒分析性能评价的参考方法[13-16],故本研究采用Cobas4800为参比方法，比较之江检测系统和MALDI-TOF MS检测系统这2种检测系统检测结果的灵敏度和特异度。结果显示MALDI-TOF MS检测系统的灵敏度和特异度均高于之江检测系统。BUSP等[8]发现基于MALDI-TOF MS检测系统检测18种HR-HPV分型的检测方法具有更高的灵敏度和特异度，本研究结论与之相符，但其研究仅涉及MALDI-TOF MS检测系统的建立及对临床标本的分析性能评价，并未对MALDI-TOF MS检测系统进行性能验证。本研究不仅涉及MALDI-TOF MS检测系统对临床HPV标本检测的分析性能评价，且对MALDI-TOF MS检测系统进行了系统的性能验证。

本研究的不足之处在于仅对MALDI-TOF MS检测系统做了分析性能评价，未结合标本的病理学结果进行临床应用评价，且由于标本量的限制和方法普及程度无法使用Digene Hybrid Capture 2等已有的参考方法进行验证。今后拟扩大样本量并结合临床病理学检测结果对MALDI-TOF MS检测系统的临床应用和性能进行评价。本研究对MALDI-TOF MS检测系统进行了分析性能验证和方法的一致性评价，以期为基于MALDI-TOF MS检测系统开发病原体传染性疾病体外诊断试剂盒的性能研究和临床应用评价提供参考依据