张 敏,刘惠娟,赵永睿,张世宁,杨亚楠

(1甘肃医学院药物分析与药物化学教研室,平凉 744000;2甘肃医学院药剂教研室;3甘肃医学院药学系)

呋塞米又名速尿、呋喃苯胺酸,是高效能利尿药,临床广泛用于充血性心力衰竭、肝硬化和肾疾病引起的水肿。目前市场上有片剂和注射剂两种剂型,婴幼儿患者在使用时多有不便,片剂服药的顺应性差,注射剂必须由专业医护人员进行操作,疼痛刺激感较强。而乳剂能够增强药物渗透性,降低毒副作用,提高生物利用度,还可以通过矫味剂改善口感,改善用药依从性[1,2]。

菜籽油俗称菜油,是十字花科植物芸苔(即油菜)的种子榨制所得的透明或半透明的液体,富含蛋白质、脂肪,具有软化血管、延缓衰老的功效。课题组利用食用级菜籽油作为油相开发口服呋塞米乳剂,采用正交实验筛选最优处方,对优化后的处方进行稳定常数、粒径大小和乳滴合并速度的测试。并且分别对优化的处方乳剂和市面上的呋塞米片剂进行大鼠体内的药物动力学考察,揭示乳剂的口服生物利用度,发现不同剂型的分布特点,为呋塞米剂型的开发和临床应用提供参考。

1 材料

电子天平(德国sartorial公司,BP211D),台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司,H-1650 R),超声波清洗机(天津奥科赛恩斯仪器有限公司,AS系列),Agilent 1260高效液相色谱(美国Agilent公司,配置1260 DAD检测器,Agilent Zorbax色谱柱),微孔针头滤器,采血管。

呋塞米原料药(武汉东康源科技有限公司,批号:20161015),尼泊金乙酯(天津市东丽区天大化工实验厂20141008),菜籽油(产自青海省油菜籽冷榨而得),呋塞米对照品(北京中科盈创生物科技有限公司,编号:100544),呋塞米片(江苏亚邦爱普森药业有限公司批号:1711150,20 mg×100片),乙腈(色谱级,天津市光复精细化工研究所),乙醇、丙三醇、肝素钠、羧甲基纤维素钠、冰醋酸均为分析纯。

SD大鼠,雄性,清洁级,体质量180-220 g,购于中国农业科学院兰州兽医研究所动物实验中心,生产许可证:(甘)2017-030。

2 方法和结果

2.1 呋塞米乳剂制备的方法和处方优化

2.1.1 呋塞米乳剂的制备方法 精密称取呋塞米约200 mg,与3 ml菜籽油均匀混合,加入乳化剂OP和甘油,研磨均匀后,加水适量,继续用力沿一个方向研磨至出现“噼啪”声,得到初乳,加入4%尼泊金乙酯乙醇溶液5 ml,将制得的初乳转移到50 ml具塞量筒中,蒸馏水荡洗3次后加水至全量,摇匀得淡黄色O/W型乳剂。

2.1.2 处方优化 通过预实验和单因素实验确定了呋塞米乳剂初乳制备过程中乳化剂OP、甘油的用量以及油水体积比的范围,考虑到三者之间可能存在交互作用,因而选取L9(34)正交表进行实验(见表1),以稳定常数作为考察指标,利用SPSS软件进行多因素方差分析,考察影响乳剂稳定性的因素,确定最优处方。

表1 呋塞米乳剂正交实验因素水平表

由表2可知,制备初乳时乳化剂OP的用量对乳剂稳定性有显著影响(P<0.05),三个因素之间不存在交互作用;由表3可知,乳化剂OP为0.4 ml、甘油为6.0 ml、菜籽油 ∶水为1 ml ∶4 ml时稳定常数平均值最小,稳定常数越小代表乳剂稳定性越好,因此确定呋塞米初乳最佳用量为乳化剂OP 0.4 ml、甘油6.0 ml、菜籽油与水的体积比为1 ∶4。

表2 呋塞米乳剂正交实验方差分析表

表3 呋塞米乳剂三因素不同水平的稳定常数估计平均值

2.1.3 呋塞米乳剂稳定性评价

2.1.3.1 稳定常数 取呋塞米乳剂10 ml置于15 ml离心管中,4 000 r/min离心15 min后,从离心管底部取出1 ml乳剂,稀释至50 ml,以蒸馏水为对照,于500 nm波长处测得吸光度A;另取原乳剂1 ml,稀释至50 ml,于500 nm波长处测得吸光度A0,稳定常数Ke=(A0-A)/A0×100%。Ke越小,乳剂越稳定。优化后的处方制备得的乳剂Ke为27.7%。

2.1.3.2 粒径大小及分布 呋塞米乳剂2 ml,加水2 ml混匀后置于光学显微镜下观察,平均粒径约为25 μm。

2.1.3.3 分层现象 半径为10 cm的离心机,4 000 r/min离心15 min,无分层,常温下放置2 h,无分层。

2.1.3.4 乳滴合并速度 取呋塞米乳剂2 ml,加水稀释后置于显微镜下观察,分别记录0,1,2,3,4 h同一视野中的乳滴数量,根据lgN=Kt/2.303+lgN0,绘制t-lgN直线,得到乳滴合并速度常数为0.182 1 h-1。

2.2 呋塞米乳剂药代动力学研究

2.2.1 动物给药与血浆采集 大鼠16只,随机分为呋塞米片剂组与乳剂组,每组8只,禁食12 h,自由饮水。按照2 mg/kg灌胃给药。呋塞米片剂组给予呋塞米混悬液(呋塞米片剂研细过80目筛,加入0.5%羧甲基纤维素钠,涡旋混匀),呋塞米乳剂组给予自制的呋塞米乳剂。分别于给药后12个时间点眼眶后静脉取血,每次0.2-0.3 ml,置于预先加入肝素抗凝的离心试管中,以4 000 r/min离心10 min,分离上清液。-20 ℃保存,使用时取出解冻。

2.2.2 色谱条件 Agilent Zorbax色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);流动相:0.2%冰醋酸水溶液(A),乙腈(B);梯度洗脱程序(0-6 min,40%-40% B;6-15 min,40%-90% B),流速:1.0 ml/min;进样量:20 μl;检测波长271 nm;温度:常温。

2.2.3 血浆样品处理 精密量取血浆样品100 μl,置于1.5 ml离心管中,精密加入300 μl 2%醋酸/乙腈溶液,涡旋混匀2 min后,以10 000 r/min离心10 min,分离上清液,经0.45 μm针头式过滤器过滤,进入HPLC分析。

2.2.4 血浆样品方法学考察

2.2.4.1 血浆样品专属性试验 空白血浆、空白血浆加呋塞米对照液、大鼠呋塞米混悬液灌胃后血浆,精密量取100 μl,按照“2.2.3血浆样品处理”的方法进行,进入HPLC分析,得到空白血浆、加样血浆以及服药血浆色谱图(见图1)。结果表明:呋塞米色谱峰分离度良好,对称性达到要求,理论塔板数大于6 000,药物的测定不受内源性物质的干扰。

A.空白血浆 B.对照品(空白血浆加呋塞米)C.服药血浆图1 空白血浆、对照品血浆及服药血浆色谱图Figure 1 HPLC of blank plasma, control plasma and drug plasma

2.2.4.2 血浆样品标准曲线和定量限试验 取空白血浆50 μl,配制成浓度分别为0.2,1,2,4,8,12.5,25 μg/ml的呋塞米血浆样品,混合均匀,按照“2.2.3血浆样品处理”的方法处理,进入HPLC分析。以呋塞米对照品的峰面积(Y)对血浆浓度作线性回归得标准方程为:Y=16.90X-4.663(r=0.993 1)。结果表明,在0.2-25 μg/ml范围内,线性关系良好。检测标准曲线最低点时,准确度在85.7%-103.5%内,RSD小于10.4%,说明0.2 μg/ml可为呋塞米血浆的定量下限。

2.2.4.3 血浆样品精密度与回收率试验 取空白血浆50 μl,配置成呋塞米浓度分别为1,4,25 μg/ml的样品,每个浓度做5份,按“2.2.3血浆样品处理”操作,进入HPLC分析。根据标准曲线方程计算药物浓度,从而计算3 d内低、中、高浓度的呋塞米日内和日间精密度。结果表明,日内精密度RSD小于6.4%,日间精密度小于10.5%。

取呋塞米标准溶液,加空白血浆50 μl,配置成质量浓度分别为1,4,25 μg/ml的样品,每个质量浓度各3份,按照“2.2.3血浆样品处理”项下方法处理,进入HPLC分析,记录峰面积A1。另外取空白血浆50 μl,按照血浆样品处理方法制得上清液,用上清液配置对应浓度的呋塞米对照品,进入HPLC分析,记录峰面积A2。计算A1/A2,即为提取回收率。结果表明,提取回收率为在84.6%-100.3%之间(见表4)。

表4 大鼠血浆呋塞米日内精密度以及日间精密度

2.2.4.4 血浆样品基质效应试验 取空白血浆50 μl,按照“2.2.3血浆样品处理”项下方法处理得到空白上清液,用上清液配置呋塞米对照品,使其浓度分别为1,4,25 μg/ml(n=3),进入HPLC分析,得到峰面积均值。另外直接配置对应浓度的呋塞米对照品,得到峰面积,二者的比值即为基质效应。结果显示,低、中、高浓度的基质效应分别为101.3%,98.6%和105.5%。

2.2.4.5 血浆样品稳定性试验 取空白血浆50 μl,配置其血浆浓度分别为1,4,25 μg/ml低、中、高3个水平,每个浓度平行各6份,按照“2.2.3血浆样品处理”项下方法处理,进入HPLC分析,记录峰面积。考察呋塞米血样在室温放置12 h,-80 ℃保存30 d,以及反复冻融3次的稳定性。结果显示,室温放置12 h的RSD为9.9%,5.6%和3.3%。-80 ℃保存30 d的RSD为10.8%,2.3%和5.7%。反复冻融3次的RSD为10.3%,9.3%,和8.6%。结果表明呋塞米在血样中稳定。

2.3 呋塞米血药浓度测定及药动学参数的计算

按照“2.2.1动物给药与血浆采集”,在给药后的0.25,0.5,1,1.5,2,2.5,3,4,6,8,10,12 h时间点取血,保存血样。按照“2.2.3血浆样品处理”方法处理,进入HPLC分析,得到各时间点血药浓度。绘制呋塞米片剂和乳剂的血药浓度-时间曲线。结果见图2。

图2 呋塞米乳剂和片剂的药时曲线Figure 2 Comparison of blood concentration-time curves of furosemide emulsion and tablet

采用DAS 2.0药动学软件包对血药浓度自动拟合,计算相关药代动力学参数。其中,达峰浓度Cmax,达峰时间Tmax为实测值,药时曲线下面积AUC采用对数梯形法计算,结果见表5。结果表明,与片剂组相比,乳剂组达峰时间和片剂组相当,达峰浓度增高,药-时曲线下面积增大,表观分布容积以及口服清除率均减小。利用“两个独立样本检验”对片剂和乳剂组各参数进行Manner-Whitney分析,渐近显著性(双尾)显示两种剂型达峰浓度Cmax、药时曲线下面积AUC、清除率CLz/F、表观分布容积Vz/F差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 主要药代动力学参数 (n=8)

3 讨论

3.1 处方优化

处方中甘油可改善菜籽油被水润湿的性能,同时增加乳剂黏性和稠度;无毒的乳化剂OP广泛应用于医药领域;尼泊金乙酯醇为防腐剂,为使其分散均匀,应在搅拌研磨下滴加[3,4];制备过程中应尽量避免出现气泡,以免影响乳化效果[5]。质量评价表明,通过处方优化的呋塞米乳剂均匀稳定,载药量高。

3.2 含量测定方法的建立

在建立乳剂中呋塞米的含量测定方法中,通过超声破乳,4%氢氧化钠溶液溶解所得到的液体,其在呋塞米的最大吸收波长处,辅料的干扰比较大。随后采取HPLC分离后,能够排除乳剂中其他物质的干扰。在选择流动相时,本论文尝试了几种流动相体系后证明,在0.2%醋酸溶液-乙腈的条件下,色谱峰对称性良好,保留时间适中。在后期的血浆样品分析中,同样适用。

血浆样品的前处理方式中,加入3倍体积的2%醋酸/乙腈溶液沉淀蛋白。醋酸,有利于蛋白沉淀,药物游离[6]。同时,加入醋酸还能抑制呋塞米电离,改善色谱峰对称性[7,8]。结果显示提取回收率和峰的对称性均良好。

3.3 呋塞米乳剂和片剂药代动力学数据分析

通过呋塞米乳剂组和片剂组药-时曲线,可以看出乳剂组血药浓度和片剂组的达峰时间相当,但乳剂组的峰浓度明显高于片剂组,曲线下面积增大。说明呋塞米乳剂被胃肠道吸收的更多。可能的原因是乳剂粒径较小,接触面增大,促进了胃肠道的吸收。另外,呋塞米乳剂在0.5 h有个小峰后,2.5 h第2次出现最大峰。可能的原因是部分未包裹进乳滴的药物游离出来被吸收,产生突释效应,吸收程度大大增加,有利于患者吸收。

呋塞米常见的剂型包括片剂和注射剂,其主要问题为溶解性和渗透性差,生物利用度个体差异大。除了环糊精包合、微球、膜剂,较少见文献报道呋塞米的其他剂型[9]。而乳剂载药量大,液滴小,渗透性强,生物利用度高,使用过程中少量剂量即能达到与片剂相同效果。同时,乳剂在口感调整上有优势,更加容易被婴幼儿患者接受,提高用药的依从性。因此,本文的研究结果,为呋塞米剂型开发提供了理论基础,具有应用前景。