段丽娟,范慧君,邢 婕,张爱荣,高晓霞,秦雪梅*

(1山西大学中医药现代研究中心,太原 030006;2山西大学化学化工学院;3山西广誉远国药有限公司;*通讯作者,E-mail:qinxm@sxu.edu.cn)

龟龄集是我国补肾填精、壮阳培本的传统古方,其处方复杂独特,由二十八味中药组成,涵括了动物药、植物药和矿物药,其功能主治为强身补脑,固肾补气,增进食欲,用于肾亏阳弱,记忆减退,夜梦遗精,腰酸腿软,气虚咳嗽,五更溏泻,食欲不振[1]。现代药理实验多集中在治疗少精症、勃起障碍、肾阳虚等男性疾病[2-5]。

在《中国长寿大辞典》中,龟龄集列益寿强身内服药之首[6],也是著名的抗衰老处方[7],具有延缓衰老的作用[8],已有研究表明龟龄集可改善大鼠衰老引起的记忆障碍作用[9]。也有研究报道龟龄集可显著延长雌雄蚕蛾的寿命[10],然而家蚕与哺乳动物差异较大,且对龟龄集的用药方法、用药剂量未详细考察。目前,龟龄集的临床使用剂量、服用疗程及受众年龄等多始于历史传承,但由于实验周期长等客观因素,其发挥延年益寿的作用的研究报道较少。

寿命是抗衰老作用研究中最直观、最重要的指标,寿命实验(生存实验)是衡量生命衰老规律和抗衰老效果的方法。果蝇遗传学知识背景深厚并且具有寿命短的优势,且果蝇具有与人类75%同源疾病相关基因,为生物实验的理想材料,现果蝇的生存实验已被作为延缓衰老作用的检验方法之一[11-14]。

本研究使用果蝇生物模型,考察筛选给药剂量和时长及给药方式,最终确定龟龄集延长果蝇寿命的最佳方法,为龟龄集临床更合理科学用药提供参考。本研究采用逆重力爬行实验及抗冷应激实验评价龟龄集的抗衰老活性,为龟龄集的抗衰老作用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

果蝇品系:W1118系白眼黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)山西大学应用生物学研究所提供,在25 ℃、75%相对湿度,光照周期为12 h的恒温恒湿环境中培养。将CO2气体通入果蝇培养瓶中将其致晕,放在通有CO2的脱脂棉上,分取雄性并收集。

1.2 试剂及仪器

龟龄集(批号:20130201,规格:0.3 g/粒),由山西广誉远国药有限公司提供,实验时药物均合格。

电子天平(型号:FA2004,上海良平仪器仪表有限公司);人工气候箱(型号:MGC-HP,上海一恒科技有限公司);立式压力蒸汽灭菌器(型号:LDZX-30KBS,上海申安医疗器械厂)。

1.3 培养基的配制

基础培养基的配制:参考文献基础培养基的配制方法[15],将培养基趁热装入洗净灭菌的指管(高9.4 cm,内径2.6 cm)中,每管加入约5 ml,于干燥实验室自然晾干后室温下保存备用。

龟龄集培养基的配制:在基础培养基里加入龟龄集药粉,充分搅拌,制成0.5,1,2,4,8 mg/ml龟龄集培养基。

1.4 果蝇寿命实验

1.4.1 不同剂量龟龄集对果蝇寿命的影响 参考文献[16]方法,收集3 d内羽化的雄性果蝇,使用基础培养基培养至30日龄时随机分组,即对照组和龟龄集组(含药剂量分别为0.5,1,2,4,8 mg/ml),果蝇30日龄时开始给药,直至果蝇自然衰老死亡。每组约200只,隔3 d为果蝇更换1次新鲜培养基,每日记录果蝇死亡状况直至全部死亡,意外死亡果蝇不作统计。每组果蝇的平均存活天数计为平均寿命,每组最后剩余10%果蝇的存活天数算术平均数计为最高寿命。

1.4.2 不同给药方式对果蝇寿命的影响 收集3 d内羽化的雄性果蝇,使用基础培养基培养至30日龄时随机分为对照组和龟龄集组(4 mg/ml)。将龟龄集给药时长设置为15 d,设计两种给药方式,分别为连续给药15 d后停药和间隔1 d给药,每组130只左右。分别用基础培养基及龟龄集培养基喂养,每天记录果蝇死亡状况,直至全部死亡,意外死亡果蝇不作统计。

1.5 逆重力爬行实验

收集3 d内羽化的雄性果蝇,使用基础培养基培养至30日龄时随机分为对照组和龟龄集组,每组果蝇约100只。对照组使用基础培养基饲喂,龟龄集组使用4 mg/ml的龟龄集培养基饲喂至40日龄时,将果蝇转入高9.4 cm,内径2.6 cm的空管中,其中塑料管共分为4段,每段2 cm。将待测果蝇平均装入测定管中,饥饿2 h后轻晃管,使果蝇置于底部。统计30 s后爬行距离大于4 cm的果蝇数量(A),计算攀附指数(climbing index,CI)=A/总数[17]。分别测定两组果蝇30日龄和40日龄时的攀附指数,并计算两组果蝇不同年龄下的攀附指数提高率,每组果蝇分别测定3次,每次间隔20 min。

1.6 抗冷应激实验

收集3 d内羽化的雄性果蝇,使用基础培养基培养至30日龄时随机分为对照组和龟龄集组,每组果蝇约100只。对照组与龟龄集组分别使用基础培养基和膳食中添加4 mg/ml的龟龄集培养基饲喂至40日龄时,将果蝇转移至室温下放置的空管中进行爬行实验,统计30 s后爬行距离大于4 cm的果蝇数量,记录数据并计算攀附指数。将果蝇迅速转移至碎冰上冷刺激10 s后,立即轻晃管进行爬行能力测定,爬行30 s后记录爬行距离大于4 cm的果蝇数量并计算攀附指数。计算两组果蝇冷刺激环境下较常温环境中攀附指数的提高率,每组果蝇分别测定3次,每次实验间隔20 min。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 龟龄集对果蝇寿命的影响

2.1.1 不同剂量龟龄集对果蝇寿命的影响 不同剂量龟龄集对果蝇寿命的影响结果见图1。在果蝇30-45日龄段,0.5,4,8 mg/ml龟龄集组曲线高于对照组,其他实验组曲线与对照组曲线几近重叠。而在果蝇寿命后期,各剂量组的存活率均低于对照组。推测龟龄集给药时间不宜过长，故后续实验将龟龄集给药时长定为15 d。

图1 龟龄集各剂量组与对照组生存曲线Figure 1 Lifespan curves of male Drosophila melanogaster between different Guilingji dose groups and control group

与对照组相比,0.5,4,8 mg/ml龟龄集组果蝇的平均寿命与中位寿命可不同程度地延长(见表1)。4 mg/ml龟龄集组果蝇的平均寿命和中值寿命较对照组分别延长了1.97%和4.44%,但差异没有统计学意义(P>0.05)。4 mg/ml龟龄集剂量组平均寿命和中值寿命的延长率大于0.5,8 mg/ml组,故4 mg/ml为最佳剂量,后续实验均采用此剂量。

2.1.2 不同给药方式对果蝇寿命的影响 不同给药方式对果蝇寿命影响结果见表2,图2。与对照组相比,采用连续给药方式的龟龄集组果蝇存活率得到显著提高(见图2A)。果蝇的平均寿命、中位寿命、最高寿命较对照组分别延长了16.0%,17.0%,7.7%,且差异有统计学意义(P<0.01,见表2)。与对照组相比,采用间隔给药方式的龟龄集组果蝇存活率出现先高后低的趋势(见图2B)。龟龄集组较对照组可分别延长果蝇的平均寿命5.0%(P<0.01),延长中位寿命4.3%(P<0.05),而最高寿命无改善(见表2)。

表1 龟龄集不同剂量对果蝇寿命的影响

表2 龟龄集不同给药方式对果蝇寿命的影响

A.龟龄集连续15 d给药 B.龟龄集间隔1 d给药图2 龟龄集不同给药方式果蝇生存曲线的比较Figure 2 Lifespan curves of male Drosophila melanogaster after Guilingji administration with different methods

2.2 龟龄集对果蝇爬行能力的影响

与对照组相比，龟龄集组30日龄和40日龄果蝇的攀爬能力无明显提高，差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。尚不能证明龟龄集给药15 d对果蝇攀爬能力有影响。

2.3 龟龄集对果蝇冷应激能力的影响

龟龄集对40日龄果蝇冷应激能力的影响结果见表4。对照组与龟龄集组在常温下攀附指数的差异无统计学意义，表明两组果蝇常温环境下的攀爬能力相当。与对照组相比，龟龄集组在冷刺激下果蝇的攀附指数明显提高，且差异有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明龟龄集可提高果蝇的抗冷应激能力。

表3 龟龄集对果蝇爬行能力的影响

表4 龟龄集对果蝇冷应激能力的影响

3 讨论

龟龄集组方依据传统医学“天人合一”、“阴阳五行”的整体观念,包含了植物药(红参、天冬、杜仲等)、动物药(鹿茸、海马、雀脑等)和矿物药(大青盐、石燕等)。龟龄集作为药品,临床上按照疗程用药。而作为养生名方,采用四季养生服用法,即“四立二分二至法”,立春、立夏、立秋、立冬、春分、秋分、夏至、冬至,每个节气按照剂量连服15 d,或二至(夏至、冬至)每个节气按照剂量连服45 d。动物实验不能考察时令因素对药效的影响,但可以通过考察合适的给药方法来评估龟龄集药效。

龟龄集在临床应用时多为男性用药,同时为避免雌性果蝇生殖等其他因素的影响,故本研究选取雄性果蝇为实验对象。本研究结合临床,采用果蝇自然衰老模型,考察了不同的给药剂量和给药方式2种条件,最终得到了于果蝇模型适合的给药方法。

3.1 果蝇模型的优势与给药剂量的筛选

果蝇作为常用的衰老模式生物之一,具有生命周期短而繁殖快,饲养方便且诸多代谢途径、生理功能类似于哺乳动物的优点。然而目前果蝇并未像大鼠、兔子等动物一样与人类之间有科学的药物剂量换算标准,故给药剂量需进行实验筛选确定。前期实验设计了0.04,0.2,1 mg/ml三个剂量组,生存曲线结果未观察到明显变化。根据此结果,将给药剂量设计为0.5,1,2,4,8 mg/ml。结果显示,0.5,4,8 mg/ml剂量可改善果蝇寿命情况,但考虑到0.5 mg/ml剂量较小,药效发挥可能不太稳定,而4 mg/ml和8 mg/ml两个剂量显示出剂量依赖性趋势,其中,4 mg/ml剂量组还可明显提高果蝇的平均寿命和中位生存时间,故采用4 mg/ml进行后续试验研究。

3.2 给药时长的选择

本课题组前期对果蝇进行代谢组学分析时发现，果蝇在寿命为30日龄时属于中年阶段，30日龄果蝇已经开始步入衰老[16]。故选择从30日龄开始给药，这也与龟龄集在临床使用中一般为中老年用药的经验一致。

在剂量筛选实验中发现龟龄集可提高果蝇30-45日龄的存活率，推测龟龄集给药时长不宜过长。因此，将给药时长设置为15 d。

3.3 给药方式的考察

中华民族在中医药理论的指导下,形成了一套完整的养生体系。二十四节气反映了大自然的气候变化,中医学将二十四节气与阴阳学说相结合,以阴阳相衡为原则,在四立二分二至时服用养生补健方以达到延年益寿、滋心肺润五脏的目的。考虑到临床实际使用的“四时养生”服用法,实验中还比较了隔天给药的给药法,但其延长寿命结果不明显。推测由于果蝇寿命周期过短,尚不能模拟人类机体随节气更迭而产生的变化,故不能体现中医按照节令给药的科学性。

3.4 爬行实验与冷应激实验的作用

机体运动能力和冷应激能力是衰老的两个指标，本研究采用攀附指数评价龟龄集对果蝇机能的影响。龟龄集对40日龄果蝇的运动能力无明显提高作用，推测可能果蝇在40日龄时由于机体的衰老，龟龄集只能有限地提高果蝇的运动能力。而且本研究还通过测定40日龄果蝇在冷刺激下的攀附指数评价龟龄集对果蝇抗冷应激能力的影响，实验结果表明龟龄集可提高果蝇的抗冷应激能力。

综上所述,龟龄集可延长果蝇寿命,龟龄集的最佳给药方式为在果蝇30日龄时给药,连续15 d后停药。龟龄集可改善果蝇抗冷应激能力,龟龄集确实具有延缓衰老药效。在后期研究中可采集各年龄段的生物样本使用代谢组学技术、网络药理学等新技术,增加抗氧化酶活力的测定等其他指标辅助验证龟龄集延缓衰老的作用,进一步探讨龟龄集抗衰老机制。