李莎莎,李 露,吴 璞,郝亚宁

(1西安医学院第一附属医院肾内科，西安 710077；2西安市第九医院肾内科；3西安交通大学第一附属医院肾内科;*通讯作者,E-mail:haoynhaoyn@163.com)

尿酸(uric acid，UA)是人类嘌呤代谢的终产物，由于尿酸氧化酶在人类长期进化过程中发生基因突变不能将尿酸氧化为尿囊素，故人类嘌呤代谢的最终产物仅为尿酸，且主要经肾脏排泄[1]。因此研究高尿酸血症与肾脏损害的关系具有至关重要的临床和实际意义。近年来国内外大量研究[2]表明高尿酸与肾脏的关系不仅仅是引起肾小管-间质尿酸结晶形成、间质炎性细胞浸润等慢性间质性肾炎的形态学变化，更重要的是尿酸可参与肾小球内“高压力、高灌注、高滤过”，引起炎症反应、血管病变及肾小球固有细胞损伤并由此诱发和加重肾脏损害。我们课题组前期研究发现尿酸可诱导体外培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖及表型转化[3]。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是肾小球系膜细胞表型转化的标志蛋白。肾小球系膜细胞发生表型转化过程中，系膜细胞发生了形态学、细胞骨架结构和功能的改变。总的包括以下三方面：形态学变化就是细胞从紧密融合的不规则形转变为长梭形的典型肌成纤维细胞形态；肌纤维母细胞的典型标志α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)大量表达；分泌大量细胞因子如转化生长因子(TGF-β1)等及细胞外基质成分如纤维连接蛋白(fibronectin)等。

内质网应激反应是细胞整合多条信号通路，调节生理或病理反应的重要途径之一，可决定细胞增殖、分化、凋亡等命运[4]。故可能在尿酸引起系膜细胞表型转化过程中起重要作用。内质网分子伴侣糖调节蛋白78(GRP78)作为多功能调节剂,当内质网处于稳态时,GRP78能结合内质网上未折叠蛋白堆积的感受器蛋白的内质网内端，维持信号转导因子的非活化状态。蛋白质二硫键异构酶(protein disul-fide isomerase,PDI)是内质网中含量最丰富的蛋白质之一,它是促进蛋白质结构中二硫键形成的蛋白酶。当PDI减少时,错误折叠的蛋白质增多且细胞凋亡程序启动,促进细胞死亡。

4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)是通过化学合成的,具伴侣活性的小分子质量脂肪酸,能稳定蛋白构象,改善内质网折叠蛋白能力,减轻ERS反应的发生。故推测4-PBA可能对NAFLD具有潜在的保护作用。本研究动态观察在高尿酸环境下，大鼠肾小球系膜细胞表型转化情况和内质网应激发生情况,以期明确尿酸诱导大鼠肾小球系膜细胞发生表型转化过程中内质网应激的作用并初步阐明其机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)购自中国典型物保藏中心，DMEM培养基，尿酸、4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)及毒胡萝卜素(thapsigargin)购自美国Sigma公司，反转录试剂盒、PCR引物购自中国大连Takara宝生物工程有限公司,PCR扩增仪、凝胶成像分析仪均购自Bio-Rad公司。TECNAI G2 F30 S-Twin型透射电镜购自荷兰Philips-FEI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)贴壁培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于5%CO2、37 ℃饱和湿度的培养箱中培养。根据细胞状态及生长速度决定换液时间，一般2-3 d更换一次培养基，待贴壁细胞长至80%-90%融合时，以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化传代，选择对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 实验分组 毒胡萝卜素(thapsigargin)是一种内质网应激反应诱导剂，为验证尿酸可诱导HBZY-1发生内质网应激反应，将细胞随为：control组，thapsigargin(0.25 μmol/L)组，UA(0.2 mmol/L)组。为进一步检测不同浓度组尿酸作用HBZY-1不同时间对内质网应激反应指标GRP78、PDI的影响，将细胞随机分为不同浓度尿酸组(0.05，0.1，0.2，0.4 mmol/L)作用48 h；再应用尿酸(0.2 mmol/L)分别作用24，36，48 h。为检测内质网应激反应抑制剂4-PBA的干预作用，将细胞随机分为control组，control+4-PBA(0.25 μmol/L)组，UA(0.2 mmol/L)组，UA+4-PBA组(0.25 μmol/L 4-PBA预处理HBZY-1细胞6 h，加入0.2 mmol/L尿酸干预48 h)。

1.2.3 细胞一般形态观察 分别在倒置显微镜及透射电镜下分别观察control组、control+4-PBA(0.25 μmol/L)组、UA(0.2 mmol/L)组和4-PBA+UA组细胞形态学及超微结构变化，并拍照采集图片。

1.2.4 RT-PCR检测GRP78、PDI 严格按RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒说明提取细胞总RNA并行定量及纯度鉴定。逆转录为cDNA，PCR扩增反应体系25 μl，上下游引物均由大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)设计合成(见表1)，反应条件如下：预变性：94 ℃，30 s；变性：95 ℃，30 s；退火：55-65 ℃，30 s；延伸：72 ℃，30 s，共30个循环，每组重复6次，扩增结束后即可置于微量离心机上3 000 r/min，离心30 s，可用于琼脂糖凝胶电泳。在Bio-Rad凝胶成像分析系统中拍照，并用自带软件对结果进行灰度分析，计算各项指标灰度值与内参β-actin的灰度值之比代表其相对强度。

1.2.5 Western Blot法检测GRP78、PDI、α-SMA、TGF-β1及Fn 按试剂盒说明书提取细胞总蛋白并测定浓度。进行聚丙烯酰胺凝聚电泳，半干转移法降蛋白转移至硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶粉配制一抗，本实验中α-SMA、TGF-β1、Fironectin、GRP78、PDI及β-actin一抗的稀释度依次为1 ∶400，1 ∶250，1 ∶1 000，1 ∶400，1 ∶400，1 ∶400。4 ℃孵化1 h，TBST液洗涤3次，用5%脱脂奶粉配制二抗，按1 ∶15 000稀释，加入二抗室温孵化1 h后，通过Western blot曝光观察，测定各蛋白表达量。

表1 RT-PCR各引物序列

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 尿酸可诱导大鼠肾小球系膜细胞发生内质网应激反应

Western blot印迹显示，0.25 μmol/L毒胡萝卜素及0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1细胞48 h，均可诱导内质网应激反应标志性指标GRP78,PDI蛋白表达增加，且与control组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。

与control组相比，*P<0.05图1 0.25 μmol/L毒胡萝卜素与0.2 mmol/L尿酸对HBZY-1细胞GRP78、PDI蛋白表达的影响Figure 1 Effect of 0.25 μmol/L thapsigargin and 0.2 mmol/L UA on expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

RT-PCR结果显示，除0.05 mmol/L及0.1 mmol/L组外，0.2 mmol/L及0.4 mmol/L组GRP78及PDI mRNA的表达与0 mmol/L比较，差异有统计学意义(P<0.05，见图2)。

与0 mmol/L相比，*P<0.05图2 不同浓度尿酸对HBZY-1细胞GRP78,PDI mRNA表达的影响Figure 2 Effect of uric acid on mRNA of GRP78 and PDI in HBZY-1 by RT-PCR

RT-PCR结果显示，0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1细胞24，36，48 h，各时间组GRP78及PDI mRNA的表达与0 h比较，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

Western印迹结果显示，0.2 mmol/L尿酸作用于HBZY-1细胞24，36，48 h，各时间点GRP78及PDI蛋白的表达与0 h比较均升高，差异有统计学意义(P<0.05，见图4)。

与0 h相比，*P<0.05图3 0.2 mmol/L尿酸作用不同时间对HBZY-1细胞GRP78及PDI mRNA表达的影响Figure 3 Effect of 0.2 mmol/L uric acid for different time on mRNA of GRP78 and PDI in HBZY-1

与0 h相比，*P<0.05图4 0.2 mmol/L尿酸作用不同时间对HBZY-1细胞GRP78及PDI蛋白表达的影响Figure 4 Effect of 0.2 mmol/L uric acid for different time on expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

2.2 尿酸对大鼠肾小球系膜细胞的形态学影响及4-PBA的干预作用

control组及4-PBA组HBZY-1细胞呈紧密的单层融合的三角形、不规则型贴壁生长,而UA组HBZY-1细胞体积增大,两端突起呈长梭形,类似纤维细胞样形态(见图5)，而UA+4-PBA组HBZY-1细胞形态亦呈紧密的单层融合的三角形、不规则型贴壁生长。透射电镜下control组及4-PBA组HBZY-1细胞微毛密长,而0.2 mmol/L UA组细胞表面微毛短缩,融合,数量减少,内质网明显扩张，而UA+4-PBA组HBZY-1细胞微绒毛密长，内质网轻度扩张(见图6)。

图5 4-PBA对HBZY-1细胞形态的影响 (倒置显微镜，×100)Figure 5 Effect of 4-PBA on phenotypic change in HBZY-1 cells (inverted microscope, ×100)

图6 4-PBA对HBZY-1细胞超微结构的影响 (透射电镜,×20 000)Figure 6 4-PBA on ultrastructure changes in HBZY-1 (transmission electron microscope, ×20 000)

2.3 内质网应激反应相关指标GRP78、PDI在尿酸诱导的大鼠肾小球系膜细胞表型转化中的变化及4-PBA的干预作用

Western印迹结果显示，与control组比较，4-PBA组GRP78及PDI蛋白表达无明显变化，而UA组GRP78及PDI蛋白的表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与UA组比较，UA+4-PBA组GRP78及PDI蛋白的表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05，见图7)。

与control组相比，*P<0.05；与UA组相比，#P<0.05图7 4-PBA对HBZY-1细胞内质网应激蛋白GRP78及PDI表达的影响Figure 7 Effects of 4-PBA on the expression of GRP78 and PDI proteins in HBZY-1

2.4 α-SMA、TGF-β1、Fn在尿酸诱导的大鼠肾小球系膜细胞表型转化中的变化及4-PBA的干预作用

Western blot印迹结果显示，与control组比较，4-PBA组α-SMA、TGF-β1、Fn蛋白表达无明显变化，而UA组GRP78及PDI蛋白的表达均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与UA组比较，UA+4-PBA组α-SMA、TGF-β1、Fn蛋白的表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05，见图8)。

3 讨论

肾小球硬化是多种慢性肾脏疾病终末期的最后归途，最终导致肾功能衰竭，对机体造成极大危害。大量研究表明，各种肾脏固有细胞包括系膜细胞、足细胞、近端肾小管上皮细胞在肾脏疾病发生发展过程中均可发生表型转化，并由病变初期的受损靶细胞转化而主动参与病变进程[5]。其中，肾小球系膜细胞表型转化在肾小球病变从早期的炎症反应向晚期的硬化发展过程中起重要作用。肾小球系膜细胞是肾脏的主要固有细胞之一，正常情况下，肾小球系膜细胞仅履行吞噬、维持细胞外基质正常代谢，通过收缩调节肾小球滤过率等功能[6]。但由于系膜细胞和毛细血管袢之间不存在基底膜，系膜细胞直接与毛细血管袢相邻接，任何来自血流异常信号如高血糖[7]、高血脂[8]、缺血损伤、血流动力学改变、晚期糖基化终末产物(AGEs)堆积、系膜区免疫复合物沉积等多种病理因素损害情况下均可直接刺激系膜细胞，使之增殖、肥大，分泌大量细胞外基质并出现形态、结构、功能的改变，由静止/成熟表型转化为增殖/分泌表型，即转分化具有肌成纤维细胞样特性，重新表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，导致各种细胞因子如转化生长因子β(TGF-β)、血小板衍化生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等释放，促进肾小球硬化[9]。

与control组相比，*P<0.05；与UA组相比，#P<0.05图8 UA对HBZY-1细胞表型转化蛋白α-SMA、TGF-β1及Fn表达的影响及4-PBA的干预作用Figure 8 Effects of UA and 4-PBA on the protein of α-SMA, TGF-β1 and Fn in HBZY-1

我们课题组前期研究[3]发现0.1 mmol/L以上的尿酸可诱导体外培养的大鼠肾小球系膜细胞形态从三角形、不规则形转化为长梭形类似纤维细胞样形态，且表型转化特异性指标α-SMA mRNA及蛋白水平表达增强，致纤维化因子TGF-β1的mRNA和蛋白表达亦明显上调，同时细胞外基质成分fibronectin的mRNA和蛋白表达也同时上调，均提示尿酸可诱导体外培养的系膜细胞从静止/成熟型转化为增殖/分泌型，与肾小球硬化硬化有关[10]。

内质网是细胞内胆固醇、类固醇等其他脂质生物合成的重要部位，同时也能合成多种分泌蛋白及结构蛋白，并且为蛋白质的正确折叠提供稳定的内环境，同时也是钙离子的储存场所。正常情况下，内环境的稳定是内质网发挥正常功能的基本条件。其主要由未折叠蛋白反应这一适应性的程序调控。研究发现内质网应激反应涉及到多种病理损伤机制，如脂质过度负荷、缺血、神经变性及功能紊乱、感染、药物、毒素等均可扰乱内质网的稳态，导致大量错误或未折叠蛋白在内质网聚集，通过激活下游包括PERK、ATF6、IRE1等信号通路，引起一系列的细胞反应[11]。内质网应激及其诱导的细胞凋亡参与了许多疾病的病理生理过程。近年来，国内外多项研究[12]表明内质网应激反应与肾脏疾病密切相关。

在本实验中，与对照组比较，在一定时间及浓度范围内，尿酸可诱导内质网应激反应内质网分子伴侣GRP78及PDImRNA及蛋白高表达，证实尿酸可诱导大鼠肾小球系膜细胞发生内质网应激反应。

尿酸可诱导大鼠肾小球系膜细胞从单层融合的三角形、不规则形态转化为两端突起呈长梭形,类似纤维细胞样形态，超微结构可见尿素组系膜细胞微绒毛短小，内质网明显扩张。尿酸也可诱导系膜细胞表型转化特异性指标α-SMA、TGF-β1、FN mRNA及蛋白的表达，为了验证高尿酸诱导肾小球系膜细胞表型转化与内质网应激相关性，本研究应用内质网应激反应抑制剂进行干预。4-苯基丁酸(4-PBA)是一种具有分子伴侣作用的短链芳香族脂肪酸,它可以逆转蛋白质分子的错误移位和错误聚集并帮助其建立正常的空间结构,从而具有抗内质网应激和诱导分化的作用[13]。本研究中发现，应用4-PBA干预大鼠肾小球系膜细胞，不仅可明显减轻尿酸诱导的GRP78和PDI的表达，即减轻内质网应激，而且显著抑制大鼠肾小球系膜细胞表型转化特异性指标α-SMA、TGF-β1、FN mRNA及蛋白的表达，提示高尿酸条件下内质网应激反应参与体外培养的大鼠肾小球系膜细胞表型转化。

综上，本研究表明内质网应激反应参与尿酸诱导的大鼠肾小球系膜细胞表型转化，其抑制剂4-PBA可抑制该过程，同时为高尿酸肾病发病机制提供新的理论依据。但尿酸性肾病发病机制十分复杂，内质网应激反应相关下游信号通路是否参与其中，还需进一步探索及补充。