黄乐宇 ，袁小红 ，2＊＊

（1. 广州中医药大学第二附属医院 广州 510120；2. 广东省中医院科学院 广州 510006）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是比较典型的糖尿病微血管并发症，其发病机制复杂，多种致病因素相互影响，其主要成因是患者的血糖持续升高、肾脏微血管发生病变而引起肾小球硬化，同时更是导致患者产生终末期肾病的重要原因[1]。其基本病理特征是肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜基质增生与肾小球硬化，临床主要表现为蛋白尿、高血压、水肿以及不同程度的肾功能损害[2]。随着糖尿病的发病率不断升高，DN 的发病率也呈上升趋势。西方国家DN的发病率，占据了终末期肾病的近44%[3]。现代西医治疗DN，基本以降糖、调脂，配合应用血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管紧张素受体拮抗剂（angiotensin receptor blocker，ARB）类药物进行冶疗[4]，但是不能完全阻断DN 的发生和发展，中医药在治疗DN 上有其独特的优势，能够显著改善患者症状，有效减少尿蛋白，改善肾功能，从而延缓DN进程[5]。

中药复方尿毒灵是广东省中医院黄春林教授长期以来治疗糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)、慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)、肾纤维化的有效方剂。该方为院内制剂，主要由黄芪、大黄、三七、淫羊藿等中药组成[6]，临床研究表明该方可降低DN 患者的尿蛋白、尿白蛋白排泄率，同时可在一定程度上改善糖脂代谢紊乱，起到保护肾脏，延缓DN 和肾纤维化进程的作用[7]。中药治疗疾病是通过多成分作用于多靶点的错综复杂的过程，尿毒灵复方治疗DN 也是如此，前期的研究结果表明，尿毒灵能够抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖[8]，阻止甚至逆转肾小管上皮细胞的转分化作用[6]，但这只是尿毒灵作用机制的一小部分，尚需要不断地挖掘，深入研究。

网络药理学作为一门结合系统生物学及计算机技术的新兴学科，目前已经广泛应用于中药复方研究，多数复杂疾病都与复杂的生物网络紧密相关，单靶点的干预策略对此多有不足，因此，以网络为特点的复杂病证适宜于“多靶点”的组合干预[9]。为了更全面地探讨尿毒灵的作用机制，本研究运用网络药理学的方法，通过TCMSP数据库筛选出尿毒灵中可能的活性成分，并将目标成分对应的靶点与DN 疾病靶点进行匹配，从而检索出尿毒灵治疗DN 的关键靶点，构建成分-靶点网络，预测尿毒灵的活性成分及作用的靶点和通路，为进一步的作用机制研究提供依据。

1 方法

1.1 糖尿病肾病差异性表达基因的收集

应用 GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD数据库（http://systemsdock. unit. oist. jp/iddp/home/index）、CTD 数据库（http://ctdbase.org/）、DisGeNET 数据 库 (http://www. disgenet. org/web/DisGeNET/menu/search)、DrugBank 疾病靶点筛选数据库（https://www.drugbank.ca/），以“diabetic nephropathy”为检索词获取DN 靶点。删除重复冗杂的基因和假阳性基因，合并5个数据库所获得的数据，将最后筛选出的靶点基因全称输入DrugBank获取基因简称和Uniprot ID。

1.2 尿毒灵复方中化学成分及预测靶点的收集

使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）选择与尿毒灵有关的化学成分，结合文献报道，以药物口服生物利用度（OB）≧30%，类药性（DL）≧ 0.18 作为筛选条件[10-12]。借助蛋白质数据库（Uniprot），限定物种为“人”，将收集到的靶点蛋白名称转换成基因的ID名称。

1.3 “尿毒灵化学成分-作用靶点”网络的构建

将尿毒灵的预测靶点与DN 差异性表达基因取交集，所得交集靶点即为尿毒灵作用于DN 的预测靶点。利用Cytoscape 软件构建中药化学成分-作用靶点网络，探究预测靶点与化学成分之间的相互作用。

1.4 PPI 网络的构建及关键靶点筛选

在 STRING 数据库（https://string-db.org/）中分析蛋白质和蛋白质之间的相互作用，导入交集靶点，得到尿毒灵作用于DN 的靶蛋白相互作用网络。利用Cytoscape 软件构建网络图并对其进行分析，以自由度（Degree）、介数（Betweenness）、中心性（Closeness）都大于平均值作为关键靶点的筛选条件。

1.5 GO分析和KEGG通路富集分析

将交集靶点导入DAVID 6.8 数据库，限定物种为“Homo Sapiens”，设定阈值P＜ 0.01，进行GO 生物过程富集分析。设定阈值P ＜0.05，进行KEGG 通路富集分析。GO 富集分析结果以柱状图形式进行可视化展示，KEGG通路富集以气泡图的形式进行可视化展示。

1.6 整体研究思路

研究过程见图1。

2 结果

2.1 DN相关差异性表达基因检索结果

在 CTD、TTD、DISGENET 3 个 数 据 库 中 以“diabetic nephropathy”为检索词获取 DN 靶点，在DrugBank 数据库中通过反向搜索药物治疗疾病靶点，排除未经验证的靶点，分别获得靶点36 个、17 个、52个、475 个，删除重复冗杂的基因共获得基因靶点528个，将528个疾病靶点与GeneCard 搜索得到的2391个疾病靶点取交集，共获得211 个疾病靶点,将靶点信息进行基因名和Uniprot ID的标准化。

2.2 候选化合物及靶点的筛选

收集尿毒灵中所含的化合物，在TCMSP 中，根据筛选阈值，共得到候选化合物67 个，其中10 个候选化合物无靶点，重复靶点仅保留1个，将靶点信息进行基因名标准化，共获得152个化合物靶点。

2.3 成分-靶点网络构建及分析结果

图1 整体研究思路

表1 尿毒灵中筛选出的与DN靶点相关的39个候选化合物成分

利用Bioinformatics & Evolutionary Genomics 平台将化合物基因靶点与疾病基因靶点进行匹配并绘制韦恩图（图2），得到46个共同靶点基因，对应尿毒灵复方中的39 个候选化合物，化合物信息见表1。利用Cytoscape 作图软件绘制中药化合物-靶点作用网络，网络中有85 个节点（其中化合物节点39 个，靶基因节点46 个）和323 条边（图3）。对靶点网络进行分析，节点代表尿毒灵中的化学成分与潜在作用靶点；边展现了化学成分和其作用靶点之间的相互联系，根据网络关系图筛选出尿毒灵作用于DN 的目标化合物。以度值大小排序，前10 位化合物见表1，分别为槲皮素（quercetin），其次为山柰酚（kaempferol），β-谷甾醇（beta-sitosterol），木 犀 草 素（luteolin），7-O-methylisomucronulatol，豆甾醇（stigmasterol），芦荟大黄素（aloe-emodin），异鼠李素（isorhamnetin），脱水淫羊藿素（Anhydroicaritin），C-Homoerythrinan,推测这些化合物可能是尿毒灵治疗DN的关键化合物。

图2 疾病靶点与化合物靶点基因的匹配

2.4 “尿毒灵-DN交集靶点”PPI网络的构建及关键靶点筛选

中药治疗疾病的机制是一个复杂的过程，不仅仅是通过直接地作用于信号通路，在靶点和通路之间可能存在一定程度的信号转换。因此，对交集靶点进行PPI 网络分析，以探究靶点之间相互作用的关系。如图4所示，网络中有45个靶点发生蛋白相互作用（1个靶点未发生蛋白相互作用），341 条边表示蛋白的相互作用。利用Cytoscape 软件对网络进行分析，网络中节点的平均自由度为15.2，平均介数为0.019，平均中心度数0.655，3 个数值均超过平均值的靶点有13 个（表2），推测这些靶点可能是尿毒灵治疗DN 的关键靶点。

2.5 GO功能分析

选取P 值排名前10 的相关功能信息（表3、图5）。结果显示尿毒灵活性成分主要富集在应对药物反应、一氧化氮生物合成过程的正调控、ERK1和ERK2级联的正向调节、细胞增殖的正向调控、以DNA 为模板转录的正向调节、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、基因表达的正向调控、对雌二醇的反应、凋亡过程的负调节、成纤维细胞增殖的正向调控等生物过程中；分子功能方面参与了酶结合、蛋白质同二聚体活性、药物结合、转录因子结合类固醇激素受体活性、染色质结合、细胞因子活性等；与细胞外间隙、质膜、胞外区等细胞组成相关。

图3 化合物-靶点网络图

图4 尿毒灵治疗DN靶蛋白PPI网络图

表2 尿毒灵治疗DN的13个可能关键靶点的基本信息

2.6 KEGG通路富集分析结果

经过KEGG 通路富集分析，显示该46 个靶点显著富集在78 条通路上（P＜ 0.05），其中与DN 相关的前5条通路分别为HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、PI3KAkt 信号通路、MAPK 信号通路、VEGF 信号通路等（图6），其中，PI3K-Akt信号通路的富集基因数最多，为12个基因；富集程度最高的通路为HIF-1 信号通路，富集的基因数为9 个，提示尿毒灵可能是通过以上多条通路作用于DN。

表3 药物-疾病交集基因具有的功能信息

3 讨论

DN 是糖尿病严重的并发症之一，据估计，糖尿病导致的终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）占全世界发病患者的30%-47%[13]。其发病机制复杂，主要涉及血流动力学改变、细胞凋亡、炎症刺激、氧化应激等各个方面[14]。近年来，中医药在防治DN 发生发展、改善肾功能恶化等方面均取得了较大进展。

广东省名老中医黄春林教授认为肾虚血瘀是DN发病的核心病机，肾主水液，肾脏蒸腾气化作用的正常发挥取决于肾阳充沛与否，扶助肾元方可疗其根本。针对DN 基本病机，由黄芪，大黄，淫羊藿，三七等中药组成了尿毒灵方剂应用于临床，方中黄芪配伍淫羊藿共为君药，既能补气健脾，又行温肾助阳除湿之效。臣药大黄活血通腑泻浊，三七化瘀生新，以上四味药合用，共奏益气助阳、化瘀泄浊之功。严雪[7]对尿毒灵颗粒对于早中期DN 患者的临床疗效进行了初步的观察与探讨，结果发现尿毒灵颗粒可以显著改善早中期DN 患者的中医临床症状，能够降低DN 患者的尿蛋白、尿白蛋白排泄率，并且在一定程度上改善糖脂代谢紊乱，起到延缓DN进展的作用。李显波[15]在尿毒灵对DN 肾功能不全的临床和实验研究中发现，经尿毒灵治疗后，DN 肾功能不全患者的临床症状改善明显，血肌酐和尿素氮水平降低，尿毒灵治疗终末期DN疗效确切，有效率达到86.67%。动物实验研究表明尿毒灵可明显改善DN 大鼠的症状，降低血肌酐和尿素氮，纠正脂质代谢紊乱，减少蛋白尿的排泄，改善血液高凝状态的作用。还能够抑制肾组织中细胞外基质的积聚，减少体内尿素氮和肌酐的来源，延缓肾功能恶化的进程等[16-18]。细胞实验结果表明，尿毒灵对高糖刺激的肾小球系膜细胞以及对TGF-β1 诱导的HK-2细胞均具有一定的保护作用。

图5 GO富集分析柱状图

DN 的发病机制错综复杂，而尿毒灵的化学成分也很复杂，因此，其疗效是多成分综合作用的体系。网络药理学作为一门系统性的学科，可以构建虚拟的多对多的复杂网络体系，其以整体性、系统性、药物相互作用的角度对复方中各中药进行剖析，与中医药多成分、多靶点的特点不谋而合，是研究中药复方物质基础的有力辅助筛选工具。为了更深入地探讨尿毒灵的作用机制及药效物质基础，本实验以网络药理学的方法进行虚拟筛选，探讨尿毒灵治疗DN 的药效成分和作用机制，为进一步的研究提供方向。

图6 尿毒灵治疗DN关键靶点参与的通路富集信息

构建尿毒灵及DN的交集靶点PPI网络，对网络进行分析，得到 VEGFA，TP53，NOS3，TNF，RELA，IL-1β，IL-6，PPARG，CASP3，EGFR，PTGS2，AR，SOD1 等13 个关键靶点。据有关研究报道，VEGFA 在DN 动物肾脏中处于高表达的水平，干扰其表达后肾功能得到明显改善[19]。microRNA-770-5p 通过靶向 TP53 调节凋亡抑制剂1 而调节足细胞凋亡，进而参与DN 的发展[20]。也有研究初步发现，NOS3 基因多态性可能与DN 易感性有关[21]。相关临床研究发现，DN 组患者的TNF-α显著高于 T2DM 组，推测 TNF-α可能与 DN 的发生发展有关[22]。在高糖刺激下糖尿病大鼠肾小球系膜细胞的p65，IL-1β，IL-6 增加[23-24]。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ）的蛋白含量及mRNA 水平变化在DN 患者血清中明显降低，其下调与TGF-β1 水平的上调具有明显负相关性，说明可能参与了DN 的发病进程[25]。报道发现，上调miR-424 可以改善 DN 症状，通过降低Caspase-3 和bax 的表达水平以及增加bcl-2 的水平，显著降低组织细胞的凋亡率[26]。徐政[27]发现，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通过介导氧化应激与内质网应激水平来调控DN。前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）是前列腺素生物合成中的关键酶，前列腺素E1 能够改善早期DN 患者血管内皮功能[28]。睾酮通过雄激素受体（androgen receptor，AR）改善波动性高糖导致人脐静脉内皮细胞损伤的作用减弱[29]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种广泛存在于生物体中的抗氧化因子，对抗氧化应激有着关键作用。研究发现DN 患者SOD 明显低于健康对照组，SOD在辅助诊断2型DN方面具有较高的灵敏度和特异性，可将SOD 作为临床早期诊断2型DN的辅助指标[30]。

度值是度量节点局部中心性的重要参数，指节点的直接邻节点数目，认为一个节点的直接相连的节点数目越多，该节点的影响力就越大，用该参数衡量节点重要性简单直观。其中，中心节点为少量连接度很高的节点。它们作为网络枢纽往往参与重要的生命活动，同时发挥着关键的生物学功能，对维系相互作用网络的稳定性起至关重要的作用[31]。从尿毒灵的成分-靶点网络关系图中，推测出复方中度值最高的前10个化合物依次为槲皮素，山奈酚，β-谷甾醇，木犀草素，7-O-methylisomucronulatol，豆甾醇，芦荟大黄素，异鼠李素，脱水淫羊藿素等，说明这些化合物可能是尿毒灵治疗DN 的潜在活性成分。其中的大多数成分在肾病的治疗方面已用文献报道，如王艳桥[32]发现槲皮素可以抑制高糖培养状态下肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMCs）的增殖，并具有时间、剂量依赖效应。山奈酚可以抑制GMCs 异常增殖与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度分泌，进而延缓了肾小球硬化的进程，起到治疗DN 的作用[33]。木犀草素能够通过上调Nrf2 激活抗氧化酶SOD、HO-1、γ-GCS 的表达，对 STZ 诱导的 DN 小鼠发挥肾脏保护作用[34]。另有文献报道，用豆甾醇处理过的糖尿病大鼠，血清葡萄糖水平、尿酸、肌酐和血脂水平上产生显著的衰减；此外，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和脂质过氧化反应水平均有改善，且肾脏中晚期糖基化产物的形成也明显减少[35]。异鼠李素能够剂量依赖性抑制糖尿病大鼠肾组织中NF-κB 系统的过度活化，降低炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1 和 TGF-β1 的蛋白和mRNA 水平[36]。对所得的成分-靶点网络进行分析，结合文献报道，槲皮素可通过抑制NF-κB 激活降低炎症环境中IL-1β的含量[37]。山奈酚能够通过靶向VEGF 从而抑制人视网膜内皮细胞增殖[38]，在β-谷甾醇和豆甾醇对小鼠急性结肠炎的治疗作用研究中，冯思敏等发现豆甾醇和β-谷甾醇显著降低结肠组织炎症因子IL-6 和环氧合酶COX-2 的mRNA 表达，另外豆甾醇还能显著抑制IL-1β的表达[39]。木犀草素能够通过降低IL-6、TNF-α及p65 蛋白表达水平来降低大肠埃希菌对呼吸道上皮细胞的毒性[40]。芦荟大黄素通过抑制Notch-1/AKT/NF-κB 信号通路从而诱导胃癌SGC-7901 细胞凋亡[41]。本文的研究结果与文献报道结果基本一致，说明该预测的结果可信程度比较高，其预测结果可作为进一步研究的思路和方向。

对交集靶点进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，结果显示，尿毒灵对治疗DN 的生物过程主要富集在对一氧化氮生物合成过程的正调控，成纤维细胞增殖的正向调控等。作用的信号通路主要涉及HIF-1信号通路、TNF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK信号通路、VEGF 信号通路等。据文献报道，高糖环境下HIF1α-KIM1 信号通路能够通过调控FN、COL-Ⅰ等相关蛋白的表达影响糖尿病肾病肾间质纤维化的发生和发展[42]。黄芪甲苷联合氯沙坦能通过调控PI3K/Akt/NF-κB 信号通路改善糖尿病大鼠的肾组织损伤状况，延缓DN 的发生发展[43]。刘桐菊等[44]采用酶联免疫吸附测定检测高糖环境下肾系膜细胞上清液中VEGF 的质量浓度，发现各给药组VEGF 的质量浓度显著下降，推测糖肾安干预DN 的作用机制可能与降低VEGF质量浓度有关。下一步可以从上述信号通路入手开展相应的实验研究。

尿毒灵是临床上治疗DN 的有效方剂，但是由于化学成分复杂多样，其作用机制尚未完全阐明。本研究借助网络药理学挖掘出尿毒灵作用于DN 可能的潜在靶点和作用机制，同时也为中药在治疗DN 方面的研究提供更多的参考方向，避免了进一步研究的盲目性。但是该方法也存在一定的局限性，如采用TCMSP数据库收集药物成分和对应靶点，库中的药物成分信息来源链接PubChem 数据库，靶点信息来源链接DrugBank 数据库，可能存在检索到的化合物不全、一些数据来源信息无法匹配等问题，并且TCMSP数据库中的中药种类只涉及500 种植物药，尚未扩大到动物药和矿物药[45]，且数据库的信息来源于发表的文献，因此，对疾病研究得越深入，对处方中中药及其化合物的研究越多，所筛选得到的结果就越可靠，其准确性与复方的化学成分研究的程度、疾病发病机制、相关靶点的研究等密切相关，因此，尚需对预测靶点通路做进一步的实验验证。