刘孟龙，于 梦，王文霞，杜远鹏

（1山东农业大学园艺科学与工程学院，泰安271018）（2泰安市东平县梯门镇农业综合服务中心）

香气是葡萄中一类重要的次生代谢物，并且种类众多，不同的香气物质之间的浓度、特性和相互之间的平衡决定了不同葡萄品种和葡萄酒的风格和典型性。在葡萄中鉴定出的几百种香气中，最重要的香气是脂肪族类、苯的衍生物类、醇类、酯类、萜类、吡嗪类和硫醇[1]。而这些香气又可根据其不同（相同）的前体和合成路线分为3类：异戊二烯途径香气、脂肪酸途径香气和氨基酸途径香气[2]。脂肪酸途径香气，也叫作绿叶挥发物，包括C6醛类、C6醇类和C6酯类，都是通过以C18多不饱和脂肪酸为前体的脂氧合酶途径产生，其中VvLOX、VvHPL、VvADH和VvAAT是脂肪酸代谢的关键基因[3-4]。而脂肪酸途径中的C6酯类，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、己酸乙酯和2-己酸乙酯是葡萄、草莓香气的主要贡献者[5]。此外，也有报道称直链脂肪族类香气是授粉或预防病原体入侵的重要信号分子[6]。萜类物质通过异戊二烯途径合成，在促进“玫瑰香型”葡萄香气方面发挥着重要作用，其特点是具有浓郁的花香和果香风味，能赋予葡萄令人舒愉的玫瑰香型风味，并且具有较低的感官阈值，即使含量不高，也能贡献明显香味。里那醇、香叶醇具有甜淡的玫瑰花香气，橙花醇具有清甜的橙花和玫瑰花香气，柠檬烯具有令人愉快的柠檬香气[7]。

大量的研究表明，不同地域的“风土条件”是造成葡萄香气多样性的主要原因。所谓的“风土条件”主要包括气候条件、土壤、栽培措施等，这些影响因素以及他们之间的相互作用都会影响葡萄和葡萄酒的质量。然而，比起土壤、砧木或栽培方式等对葡萄香气的研究，气候条件对葡萄香气及其他品质指标的研究仍然较少，尤其是不同生态因素对香气的叠加影响[8]。研究发现，春季的平均温度会对‘美乐’葡萄采收期的吡嗪类和C6类香气造成影响[9]。2013年，Pedneault等报道了生长在加拿大魁北克的耐寒葡萄香气的积累主要是由浆果生长来驱动，风味发育受到限制[10]。在轻度缺水的情况下，‘长相思’葡萄的芳香潜力最高，而严重缺水会限制香气积累，尤其是挥发性硫醇类香气[11]。

目前生态条件对葡萄香气的影响研究多是在酿酒葡萄上，以鲜食葡萄为研究对象的报道还比较少。本试验中，为探究气候因素对玫瑰香型葡萄香气的影响，以3个产地玫瑰香葡萄为试材，通过探究样品之间香气特征的差异，并结合产地的气象条件，研究了其香气与气象指标之间的关系，以期为实际生产上通过环境条件调控果实品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为2017年9月上中旬采自蓬莱市（土壤pH值为7.28）、平度市大泽山镇（土壤pH值为7.26）、东营市六户镇（土壤pH值为7.32）的成熟度一致（可溶性固形物含量为20.5%）的‘玫瑰香’葡萄。三地土壤类型均为壤土。取样植株为10年生‘玫瑰香’成龄树，篱架栽培。为避免边际效应，每个品种每个重复取样20穗，兼顾东西两侧，共60穗。采后立即用保鲜盒带回实验室，使用手持折光仪（PAL-1，日本Atago）测定可溶性固形物含量，一部分液氮冷冻后于-80 ℃冰箱中保存用于香气成分测定。

1.2 试验方法

香气物质成分的测定参考黄丽鹏等[12]的方法，略有改动。取20 g去籽葡萄样品（液氮冷冻，-80 ℃冰箱保存）于50 mL三角瓶中，加入0.5 g NaCl粉末（使香气被充分萃取）、0.5 g PVPP（抑制酚类氧化）、0.5 g D-葡萄糖酸内酯（抑制糖苷酶活性）、3 μL 0.822 g/L 2-辛醇内标和磁力转子，迅速用锡箔纸密封好。将完成活化或热解析过的萃取头（DVB/CAR/PDMS）插入样品瓶距离液面1 cm的顶空部分，在40 ℃、200 r/min加热搅拌条件下，吸附40 min，使瓶中香气物质达到气—固和气—液平衡，然后取出萃取头插入气相色谱进样口250 ℃，热解析5 min，每个样品平行测定3次。

GC-MS分析条件：载气为高纯氦气，流速为1.27 mL/min，手动进样，采用不分流模式，进样口温度250 ℃。柱温升温程序：初始40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min。质谱接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，全扫描模式，扫描范围30～450 U。各组分质谱经计算机谱库（NIST17/WILEY7）检索及资料分析，再结合相关文献进行人工解析并确认香味物质的各个化学成分，仅保留相似度（SI）大于80，且3次重复均检测到的物质。

香气各组分含量（ng/g）＝（各组分峰面积×c内标×V内标×1 000）/（内标峰面积×m）

其中，c内标表示内标2-辛醇浓度，0.822 g/L；V内标表示加入内标2-辛醇的体积，3 μL；m表示样品质量，20 g。

1.3 数据处理及统计分析

气象数据来自国家气象数据网（http://data.cma.cn）。主成分分析采用SPSS 22.0及Excel绘制。聚类热图的绘制使用 Origin 2018中的Heatmap包。皮尔逊相关性矩阵使用Omic Share平台绘制（https://www.omicshare.com）。数据统计分析采用Excel 2017和DPS软件。差异显著性分析采用DPS数据分析软件（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 蓬莱、平度和东营三地的气象条件

蓬莱、平度和东营三地的气象条件见表1。图1是以上三地气候条件的主成分分析，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分别占总变化的59.505%和40.495%，提取的2个主成分很好地解释了数据的总差异程度。由得分图可知，蓬莱、平度和东营三点之间坐标距离较远，即三地在气候条件上无明显相似性。结合载荷图和表1可知，平度7—9月昼夜温差、相对湿度均明显高于其他两地。蓬莱7月日照时数比东营同期高36.92%，8月日照时数比东营、平度同期分别高21.70%、35.66%，因此在得分图中落在了得分图中y轴负半轴。而7—9月较高的月均温和积温将东营与其他两地区分开来。

表1 蓬莱、平度和东营三地的气象条件

图1 蓬莱、平度和东营三地气候条件的主成分分析

2.2 蓬莱、平度和东营‘玫瑰香’葡萄香气成分、含量及聚类分析

从表2和图2可以看出，蓬莱、平度和东营三地‘玫瑰香’葡萄香气总量从高到低依次为平度＞蓬莱＞东营，平度较东营香气总量高32.57%；平度、蓬莱、东营三地的香气种类依次为37、27、30种。此外，平度的‘玫瑰香’葡萄在大部分香气种类中含量高于其他两地，其中主要包括脂肪酸合成途径的C6醛类、醇类和酯类；氨基酸合成途径的苯衍生物和支链脂肪族香气，如2-乙基-1-己醇；异戊二烯途径中的降异戊二烯类香气。来自不同合成途径的香气使得平度的‘玫瑰香’葡萄具有更复杂的香气层次。

蓬莱的‘玫瑰香’葡萄虽然在脂肪酸途径和氨基酸途径的香气中不占优势，但其异戊二烯途径的香气含量高于其他两地的样品，比东营的样品高91.78%，比平度的样品高22.01%。其中主要包括玫瑰醚、橙花醚和里那醇等，这些低阈值的香气是‘玫瑰香’葡萄“玫瑰香味”的主要贡献者。因此，虽然蓬莱‘玫瑰香’葡萄在香气总量和种类上不如平度的样本，但是它具有更典型的‘玫瑰香’葡萄的香味。

与蓬莱和平度的‘玫瑰香’葡萄相比，东营的样本不仅香气总量最低，在表征成熟果香味的C6酯类和玫瑰花香的里那醇上也均低于其他两地。虽然东营的样本在己醛含量上要比蓬莱和平度的样品高13.00%和19.61%，但己醛是葡萄中青草味香气的主要贡献者。因此，相较于其他两地的样本，东营的‘玫瑰香’葡萄不仅青草味略高，在花香和果香上也较为寡淡。此外，通过图2的聚类结果可知，由于东营和蓬莱的‘玫瑰香’葡萄在香气的种类和含量上（尤其是氨基酸途径和脂肪酸途径）相似度更高，因此二者的聚类效果更好。

蓬莱、平度、东营三地的‘玫瑰香’葡萄氨基酸途径香气含量普遍较低，从高到低依次为平度＞蓬莱＞东营，平度较东营氨基酸途径香气含量高311.34%，差异显著。平度和蓬莱两地在苯衍生物和支链脂肪族类香气上的积累明显高于东营，平度和蓬莱两地较东营在2-乙基-1-己醇上有比较多的积累。

表2 蓬莱、平度和东营‘玫瑰香’葡萄香气成分及含量

图2 蓬莱、平度和东营三地‘玫瑰香’葡萄香气的聚类热图

2.3 蓬莱、平度和东营‘玫瑰香’葡萄香气成分的主成分分析

对3个地区‘玫瑰香’葡萄香气数据进行主成分分析（PCA），得到2个成分的得分图及相应的载荷图（图3）。其中，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分别占总变化的45.96%和19.85%，该主成分分析的2个成分共代表总变化的65.81%。根据得分图中相应点之间的疏远程度可以得出：3次重复间的重复性良好。不同产地之间东营与蓬莱的‘玫瑰香’葡萄香气组成更相似，这与聚类结果一致。

东营样品处于第二象限中，对应载荷图中，可以得出东营地区的‘玫瑰香’葡萄对己醛和香叶醇有比较丰富的积累。平度样品处于第四象限中，靠近PC1的正半轴，对应载荷图中，平度‘玫瑰香’葡萄对直链脂肪醇、直链脂肪酯、苯衍生物、降异戊二烯类香气有丰富的积累。蓬莱样品处于第三象限中，靠近PC2的负半轴，说明蓬莱样品香气物质较前二者的变化方向不同，主要由PC2影响；对应载荷图中，蓬莱‘玫瑰香’葡萄对萜类、支链脂肪族类香气有丰富的积累。

图3 蓬莱、平度和东营三地‘玫瑰香’葡萄香气成分的主成分分析

2.4 蓬莱、平度和东营三地的环境因子与‘玫瑰香’葡萄主要香气成分的相关性分析

为进一步探究气象条件与香气之间的关系，就3个产地‘玫瑰香’葡萄的主要香气成分与其生长季的气候条件进行皮尔逊相关性分析。相关性检验表明：萜烯类香气及其代表香气里那醇与7月均温、7月积温、7月降雨、9月日照时数呈显著负相关，与7、8月日照时数呈正相关；C6类香气与8、9月的月均温、积温呈负相关，与7—9月相对湿度、昼夜温差呈显著正相关。

图4 环境因子与‘玫瑰香’葡萄主要香气成分的皮尔逊相关性系数矩阵

3 讨论与结论

葡萄的香气受多种因素的影响，其中主要的影响因素是葡萄品种和产地的风土条件[13]。而风土条件主要包括产地果实生长季的光照、降雨、温度、土壤质地和肥力等。本试验运用了主成分分析和聚类热图的手段，明确了蓬莱、平度、东营的气候差异和香气特征：蓬莱产地的8月日照时数高于其他两地，其以里那醇为代表的萜烯类香气含量最高；平度产地7—9月较大的昼夜温差是其气候特点，而其香气特征主要表现为丰富的脂肪酸途径和氨基酸途径香气；东营产地7—9月月均温和积温最高，而其己醛含量最为丰富。我们进一步用皮尔逊相关性检验从统计学水平分析验证了萜类含量与7、8月的日照时数呈正相关，与9月日照时数呈显著负相关；昼夜温差和相对湿度与脂肪族香气呈正相关。

脂肪族香气包括C6醛类、C6醇类和C6酯类，其中以己醛和反式-2-己烯醛为代表的C6醛类因为其特有的“青草味”气息又被称作是绿叶挥发物（GLVs），它不仅是下游C6酯类的重要前体，有报道表明它还是植物在响应环境中生物（非生物）胁迫中的重要信号分子。一般来说，‘玫瑰香’葡萄在果实发育过程中以60%的空气相对湿度为宜[14]，所以我们推测可能是平度7—9月较高的相对湿度促进了其GLVs类香气的大量积累，而GLVs的积累又为下游C6酯类的合成提供了充足的底物。此外，较大的昼夜温差也可能是促进平度脂肪族香气的原因之一，相似的结果在‘赤霞珠’葡萄中也有报道[15]。

萜烯类香气的积累也受多种环境因素的调控，其中光照是重要的环境因素之一。Bureau发现遮阴处理会显著降低游离态和键合态的里那醇含量[16]，而当对果穗完全遮光处理时，游离态的萜类香气几乎无法合成[17]。在本试验中，蓬莱8月日照时数明显优于其他两地，而作为中晚熟的品种，8月正是‘玫瑰香’葡萄萜类大量合成的时期。因此我们推测蓬莱产地的‘玫瑰香’葡萄其丰富的萜类香气应该主要归因于其7、8月充足的日照时数。值得注意的是，不同时期的光照对萜类香气的积累可能存在不同效应。皮尔逊相关性检验发现，7、8月的日照时数对萜类香气有正调控作用，而9月的日照却对萜类香气有负调控作用。我们推测这可能和萜类香气的积累模式有关。据报道，萜类一般在果实转色后期开始大量合成，在果实成熟时达到最高峰，而在后熟时期因为挥发会有所下降[18]。就东营而言，9月有充足的光照其‘玫瑰香’葡萄成熟度要优于其他两地，而其7月的日照又劣于其他两地，因此我们推测不适宜的光照条件可能是东营样品萜类物质含量较低的主要原因。

综上所述，较大的昼夜温差促进了脂肪族类香气的合成，果实转色到成熟时期充足的光照利于萜烯类香气的合成。