孟祥熙，温海玲，吴晓明，胡 森

(1.承德医学院附属医院烧伤整形科，河北承德 067000；2.解放军总医院第四医学中心烧伤研究所休克与多器官障碍实验室，北京 100048)

严重烧伤后，有效循环血量减少，组织缺血缺氧，引起心肌损伤、心功能降低、循环功能降低，心肌损害程度与心肌细胞凋亡、炎性反应等密切相关，烧伤早期对心脏功能的保护、提高心肌细胞对缺血缺氧的耐受尤为重要，为后续治疗争取时间[1-3]。以往研究显示丙戊酸钠(VPA)能保护失血性休克或致死性烫伤大鼠心肌功能，改善心肌能量代谢，提高生存率，但具体机制仍不明确[4-7]。为此，本实验通过观察VPA对50%体表总面积(TBSA)Ⅲ度烫伤大鼠心肌酶指标、心肌细胞凋亡情况及心肌组织内caspase-3活性、一氧化氮合酶(iNOS)表达水平、NO水平的影响，为VPA在严重烧伤早期保护心脏功能研究方面提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性SD大鼠，60～70 d龄，体重240～260 g，购进后适应性饲养1周以上，室温维持在22～25 ℃，自由饮食。实验前12 h禁食、自由饮水。

1.2 药品和试剂

VPA、戊巴比妥钠、caspase-3活性检测试剂盒(Assay Kit)购自美国Sigma公司；TUNEL检测阳性对照制备试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；NO检测试剂盒购自南京建成生物工程公司；iNOS一抗购自美国Abcam公司；小鼠抗大鼠三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

48只雄性SD大鼠，戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉，剪除背部和腹部的毛发，将大鼠放置在预制模板的矩形开口，露出裸露皮肤，同时保护剩余皮肤。分为3组(n=16)，(1)假烫组：于37 ℃水浴中背部浸泡15 s，腹部浸泡8 s，浸泡后腹腔内注射0.25 mL生理盐水;(2)烫伤组：于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s烫伤后，腹腔内注射0.25 mL生理盐水；(3)VPA 组：烫伤后腹腔给予VPA治疗(300 mg/kg，溶于0.25 mL 0.9%生理盐水)。

1.4 指标检测

烫伤后3、6 h行腹主动脉穿刺，取血标本；然后处死大鼠，胸正中线剖开取心肌组织。

1.4.1磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平检测

血标本离心后取血浆，全自动生化分析仪测定血浆CK-MB水平。

1.4.2心肌细胞凋亡率

TUNEL方法检测凋亡心肌细胞，其原理为荧光素标记的脱氧尿嘧啶核苷酸三磷酸(dUTP)在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3′-OH末端，在荧光显微镜下荧光增强。随机选取心肌组织区域中5个非重叠400高倍镜视野，计数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，心肌细胞凋亡率=凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100%

1.4.3caspase-3活性检测

casepase-3可以催化底物DEVD-p-NA产生黄色的p-NA，从而可以通过测定吸光度来检测caspase-3的活性；按照试剂盒说明书进行操作，405 nm处读取各管吸光度(A)值，观察caspase-3活性。

1.4.4NO水平检测

NO化学性质活泼，遇氧和水生成硝酸盐(NO3-)和亚硝酸盐(NO2-)，后两者遇显色剂生成淡红色偶氮化合物，通过比色可间接检测NO水平。按照试剂盒说明书进行操作混匀后，550 nm处测各管A值，根据公式计算组织NO水平(μmol/gprot)。

1.4.5iNOS表达水平

称取100 mg大鼠心肌组织，加入1 mL RIPA裂解液匀浆，于冰上静置20 min后12 000×g离心20 min，吸取上清液并用BCA法进行蛋白浓度测定。行常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜，5%脱脂奶粉封闭60 min后分别加入相应一抗：内参蛋白小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体(1∶5 000)，兔抗大鼠iNOS抗体(1∶400)，4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，每次15 min，然后分别加入相应二抗(1∶5 000)，室温孵育30 min；TBST洗3次，每天15 min，用超敏ECL化学发光液发光、曝光、显影、定影，用Image J软件分析条带灰度。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 CK-MB水平

与假烫组比较，烫伤组伤后3、6 h CK-MB水平显著升高(均P<0.05)，而VPA组CK-MB水平较烫伤组显著降低(均P<0.05)，见表1。

表1 各组血浆中CK-MB水平

2.2 TUNEL染色结果及心肌细胞凋亡率

烫伤组大鼠心肌细胞出现凋亡，肌间隙出现水肿、增宽，肌纤维排列紊乱、断裂，随时间增加心肌损伤逐渐加重;而VPA组的病理变化较烫伤组明显减轻,心肌细胞凋亡数量明显减少，肌纤维排列整齐,VPA抑制了心肌细胞凋亡，保护了心肌结构及功能，见图1。烫伤组伤后3、6 h心肌细胞凋亡率显著高于假烫组(均P<0.05)，且伤后时间越长，心肌细胞凋亡率越高，而VPA处理后心肌细胞凋亡率较烫伤组各时间点明显降低(均P<0.05)。见表2。

A:假烫组;B:烫伤组3 h;C:VPA组3 h;D:烫伤组6 h;E:VPA组6 h。

表2 各组心肌细胞凋亡率

2.3 心肌组织caspase-3活性

伤后3、6 h，烫伤组caspase-3活性(0.716±0.052、0.912±0.063)显著高于假烫组(0.435±0.034)，组间比较差异有统计学意义(t=15.167，P=0.036；t=23.734，P=0.011)；而VPA组caspase-3活性(0.527±0.046、0.672±0.047)均显著低于烫伤组(t=-10.245，P=0.036；t=-11.689，P=0.032)。见图2。

a：P<0.05，与假烫组比较；b：P<0.05，与烫伤组比较。

2.4 心肌组织iNOS相对表达水平

假烫组心肌内iNOS少量表达(0.38±0.02)，烫伤组伤后3、6 h心肌组织内iNOS相对表达水平明显增加(1.02±0.05、1.41±0.06)，较假烫组显著升高(t=45.255，P=0.019；t=55.906，P=0.004)，组间比较差异有统计学意义；而VPA组iNOS相对表达水平显著降低(0.80±0.07、1.13±0.03)，与烫伤组比较差异有统计学意义(t=-8.312，P=0.001；t=-14.033，P=0.024)。见图3。

a：P<0.05，与假烫组比较：b：P<0.05，与烫伤组对应时间点比较。

2.5 心肌组织NO水平

与假烫组比较(0.065±0.005)，烫伤组伤后3、6 h心肌组织内NO水平(0.157±0.005、0.237±0.007)显著增加，组间比较差异有统计学意义(t=43.718，P=0.010；t=71.070，P=0.000)；而VPA治疗后NO水平(0.123±0.010；0.203±0.005)较烫伤组均显著降低(t=-9.874，P=0.008；t=-13.410，P=0.005)。见图4。

a：P<0.05，与假烫组比较：b：P<0.05，与烫伤组比较。

3 讨 论

严重血容量丢失、烧/烫伤后，组织及各脏器灌注不足，极易引起心肌细胞的损伤或凋亡[8-10]，在伤员不能及时得到救治的情况下，如果给予抗休克维持药物提高伤员对休克的耐受能力，保护休克状态下的组织细胞，维持生命脏器的功能，就能为后继治疗争取时间，提高生存率。心脏功能的维持及保护，在休克救治过程中尤为重要，如何利用休克维持药物提高心肌细胞对缺血缺氧的耐受能力、抑制心肌细胞凋亡，成为近年来研究热点。

VPA是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，近年研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有细胞保护、抗氧化、抗炎等作用[11-14]。LUO等[15]通过大鼠致死性烫伤模型，证实VPA能增加心脏和大脑中组蛋白H3乙酰化水平，抑制caspase-3活性，保护心脏和大脑功能，提高生存率[15]。本实验通过建立50% TBSAⅢ度烫伤大鼠模型，研究VPA对心肌细胞凋亡的影响。心脏是维持生命的重要器官，在严重烧伤中心脏功能最易受到影响，心肌细胞出现凋亡，心脏功能降低。本实验研究表明，在大鼠致死性烫伤后，血浆CK-MB、心肌细胞凋亡率显著升高，VPA治疗后，血浆CK-MB水平明显下降，心肌细胞凋亡率明显降低，证明VPA能保护致死性烫伤大鼠心脏功能，抑制心肌细胞凋亡。

严重烫伤后，心肌细胞缺血缺氧，早期心肌出现功能损伤，心肌不断丢失，严重烫伤早期心功能的损伤与心肌细胞的凋亡有关。caspase-3是重要的促凋亡因子，参与心肌细胞凋亡，活化后发挥凋亡执行因子的作用，标志着细胞凋亡进入不可逆的阶段[16]，iNOS在心肌细胞缺血缺氧时表达显著增加，促进NO合成增加，心肌组织内NO的高水平会通过激活MAPK通路、c-jun通路等多种凋亡通路诱导心肌细胞凋亡、影响心脏功能[17-18]，对心肌组织中caspase-3活性、iNOS的表达及NO水平的检测，能反映心肌细胞的凋亡情况。研究表明，在伤后心肌组织内caspase-3活性及iNOS、NO水平显著升高，给予VPA治疗后，caspase-3活性水平及iNOS、NO水平显著降低，因此VPA能降低致死性烫伤大鼠心肌组织内caspase-3活性及NO水平，抑制心肌细胞凋亡，保护心脏功能。

综上所述，本实验通过VPA对50% TBSA Ⅲ度烫伤大鼠心脏功能及心肌细胞凋亡影响的研究，证实VPA能保护致死性烫伤大鼠心脏功能，降低心肌细胞凋亡率，其作用机制可能是通过降低心肌组织内caspase-3活性、iNOS表达及NO水平，从而抑制心肌细胞凋亡来实现的。