祁全梅，李秋荣，郭青云

（青海大学农林科学院/农业部西宁作物有害生物科学观测实验站/ 青海省农业有害生物综合治理重点实验室，青海 西宁810016）

枸杞木虱（Paratrioza sinica Yang & Li）又称猪嘴蜜、黄疸，属半翅目（Hemiptera） 木虱科（Psylloidae）[1，2]，主要分布在宁夏、青海、甘肃、新疆、陕西和内蒙古等地区[3]。其成虫如小蝉，活动范围广，全体黄褐色至黑褐色，具橙黄色斑纹，腹部背面近基部具1 条蜡白横带；若虫形似介壳虫，扁平，固着于叶面；卵椭圆形，具长柄，橙黄色[4～6]。枸杞木虱、枸杞蚜虫和枸杞瘿螨是为害枸杞的三大害虫[7～9]，枸杞木虱成虫和若虫通过刺吸叶片组织吸食汁液，造成树势衰弱和早期落叶，导致果实产量和品质降低，经济收入减少，且枸杞木虱可携带枸杞瘿螨越冬[10，11]。目前，枸杞木虱防治以化学药剂为主，而长期使用化学农药导致枸杞木虱产生了一定的抗药性，这不仅会造成环境污染，杀伤天敌，还会造成产品农药残留超标[12～14]。因此，研究与开发绿色、高效药剂或方法对枸杞木虱防治十分重要。

昆虫的嗅觉是行为感觉的一种重要信号输入来源，是其生存和繁衍的关键[15～18]。昆虫气味受体最初从黑腹果蝇中鉴定出来[19～21]，分为传统型气味受体（olfactory receptor，OR） 和非典型气味受体（olfactory receptor coreceptor，ORCO）[22，23]。OR 分布在嗅觉感觉神经元树突的膜表面，气味分子或气味分子与OBPs 的复合物通过激活对应的OR 传递嗅觉信号[24]，使昆虫产生反应；ORCO 介导的气味分子与嗅觉神经元的特异性结合是昆虫重要的嗅觉识别基础[25，26]，ORCO 与OR 相互作用形成的异源二聚体对昆虫嗅觉具有重要作用[27]。不同昆虫间的OR 多样性丰富，同源性低；而ORCO 具有高度保守性[28]。当ORCO 被干扰表达时，昆虫将显示出嗅觉缺陷，表明ORCO 有可能成为一个破坏嗅觉信号的分子靶标，对嗅觉的干扰或破坏会影响昆虫对气味和性信息素的反应，继而影响到昆虫取食以及交配和产卵等行为活动[29～31]。

深入探索与昆虫嗅觉相关的基因有助于昆虫嗅觉机制的研究，可为害虫的预防和治理提供新的方法[32，33]。但截至目前，有关枸杞木虱气味受体基因的研究尚未见报道。本研究通过对枸杞木虱ORCO 基因进行生物信息学分析，旨在为进一步研究验证该基因及其编码蛋白在枸杞木虱识别寄主以及寻找异性和产卵场所等过程中所发挥的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 序列来源

分析枸杞木虱成虫的转录组测序数据，筛选得到枸杞木虱ORCO 基因序列。

1.2 研究方法

利用分析软件（表1），对枸杞木虱ORCO 基因及其编码蛋白进行理化性质、序列特性、结构预测、进化关系等生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 枸杞木虱ORCO 蛋白理化性质分析

枸杞木虱ORCO 蛋白理化性质分析结果显示，该基因编码450 个氨基酸，分子质量约51.25 KD，等电点为6.32。组成枸杞木虱ORCO 基因编码蛋白的氨基酸有20 种，以亮氨酸含量（10.4%）最高，编码蛋白不稳定系数为37.64，属稳定蛋白；ORCO 蛋白有37 个Arg+Lys 和33 个Asp+Lys；脂肪系数为96.76，总平均亲水指数为0.254，为脂溶性蛋白。

2.2 枸杞木虱ORCO 蛋白亚细胞定位分析

枸杞木虱ORCO 蛋白亚细胞定位结果（表2）显示，枸杞木虱ORCO 蛋白位于其他细胞器，而不在细胞核。

表2 枸杞木虱ORCO 蛋白亚细胞定位结果Table 2 Subcellular localization results of ORCO protein in P. sinica

2.3 枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜区预测

枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜区预测分析结果（图1）显示，该蛋白有7 个跨膜结构，分别在第34～56 位、第 62～84 位、第 124 ～146 位、第 195 ～217 位、第322～344 位、第 354～376 位和第 424～446 位处，其中第 1～33 位、第 85～123 位、第 218～321 位和第 377～423 位氨基酸在膜内，第 57～61 位、第 147～194 位、第 345～353 位和第 447～450 位氨基酸在膜外。

图1 枸杞木虱ORCO 蛋白跨膜结构Fig.1 Transmembranc structure of ORCO protein in P. sinica

2.4 枸杞木虱ORCO 蛋白信号肽预测

信号肽预测主要是由S 值大小判断，S 值＞0.5 表示该蛋白属分泌蛋白，反之则不属分泌蛋白[34]。通过SignalP 5.0 对枸杞木虱ORCO 蛋白信号肽进行预测，结果显示，其S 值为0.001 3（图2），故该蛋白没有信号肽。

图2 枸杞木虱ORCO 蛋白信号肽预测Fig.2 Signal peptide prediction of ORCO protein in P. sinica

2.5 枸杞木虱ORCO 蛋白磷酸化位点分析

枸杞木虱ORCO 编码蛋白潜在磷酸化位点分析结果（图3）显示，6 个苏氨酸、37 个丝氨酸和7 个酪氨酸是该蛋白潜在的磷酸化位点。

2.6 枸杞木虱ORCO 蛋白保守结构域分析

Smart 分析结果（图4）显示，枸杞木虱ORCO 蛋白在第59～440 位处有1 个Pfam：7tm_6 结构域，其E值为 1.7e-88；在第 268～450 位处有 1 个 Pfam：7tm_7 结构域，其E 值为6.5e-9。

图3 枸杞木虱ORCO 潜在磷酸化位点Fig.3 Potential phosphorylation sites of ORCO protein in P. sinica

图4 枸杞木虱ORCO 蛋白保守结构域Fig.4 Conservative domains of ORCO protein in P. sinica

2.7 枸杞木虱ORCO 蛋白亲疏水性分析

枸杞木虱ORCO 蛋白亲疏水性分析结果（图5）显示，该基因编码蛋白的最大疏水性值为3.322（第52 位），最小疏水性值为-2.856（第157 位），平均疏水性为0.254。表明ORCO 蛋白属疏水性蛋白。

图5 枸杞木虱ORCO 蛋白亲疏水性Fig.5 Hydrophilicity and hydrophobicity of ORCO protein in P. sinica

2.8 枸杞木虱ORCO 蛋白二级结构预测

枸杞木虱ORCO 蛋白二级结构预测结果（图6～8）显示，枸杞木虱ORCO 蛋白二级结构中有243 个α 螺旋、80 个直链延伸、17 个β 转角和110 个无规则卷曲，分别占54.00%、17.78%、3.78%、24.44%。表明枸杞木虱ORCO 蛋白二级结构以α 螺旋为主。

图6 枸杞木虱ORCO 蛋白二级结构序列Fig.6 Secondary structure sequence of ORCO protein in P. sinica

2.9 枸杞木虱ORCO 蛋白三级结构预测

在线分析预测枸杞木虱ORCO 蛋白的三级结构，结果（图9）显示，枸杞木虱ORCO 蛋白的三级结构主要由α 螺旋和无规则卷曲缠绕折叠形成。

2.10 枸杞木虱ORCO 进化树分析

图7 枸杞木虱ORCO 蛋白二级结构预测Fig.7 The secondary structure prediction of ORCO Protein in P. sinica

图8 枸杞木虱ORCO 蛋白二级结构峰值变化图Fig.8 Secondary structure peak change graph of ORCO protein in P. sinica

图9 枸杞木虱ORCO 蛋白三级结构Fig.9 Tertiary structure of ORCO protein in P. sinica

从枸杞木虱非典型气味受体进化树（图10）可以看出，昆虫的ORCO 基因以目为分类单元进行聚类，近缘种只检索到黄伪毛蚜（Sipha flava）、桃蚜（Myzus persicae）、豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）、棉蚜（Aphis gossypii）、玉米蚜 （Hopalosiphum maidis） 和高粱蚜（Melanaphis sacchari）等半翅目蚜科昆虫，枸杞木虱的ORCO 与这些蚜科昆虫聚为一支；而鞘翅目和鳞翅目昆虫的ORCO 则形成独立的分支。

3 结论与讨论

本研究结果表明，枸杞木虱ORCO 编码450 个氨基酸，分子质量约51.25 KD，等电点为6.32，属于稳定蛋白，亚细胞定位预测枸杞木虱ORCO 蛋白主要分布在其他细胞器而不是细胞核，这与向侯君等[30]对斑翅果蝇ORCO 基因的分析结果相似；枸杞木虱ORCO基因是具有7 个跨膜结构域，N 末端在胞内、C 末端在胞外的的G 蛋白偶联受体，这与双委夜蛾、麦蛾、悬铃木方翅网蝽等昆虫的 ORCO 基因特性[27，34～39]相同。

通过基因S 值对枸杞木虱ORCO 蛋白信号肽进行预测，该蛋白基因S 值（0.001 3）＜0.5，不属分泌蛋白。通过蛋白保守结构域分析可知，枸杞木虱ORCO在第6 与第7 跨膜区、第7 跨膜区具高度保守结构域。亲疏水性分析发现，该虫ORCO 基因编码蛋白属于疏水性蛋白。枸杞木虱ORCO 蛋白的二级结构以α螺旋为主，且无规则卷曲和直链延伸也占有一定比例；三级结构主要由α 螺旋和无则规卷曲缠绕折叠形成，ORCO 基因在结构上的高度保守性说明其在昆虫的一系列生命活动中有着至关重要的作用。

本研究利用生物信息学软件对柴达木地区枸杞的主要害虫枸杞木虱ORCO 基因及其编码蛋白的理化性质、序列特性、结构预测和进化关系等进行了系统分析，为研究枸杞木虱新的防治靶标奠定了理论基础，而对枸杞木虱ORCO 基因的克隆、蛋白表达和功能验证有待下一步研究。

图9 枸杞木虱与其它昆虫ORCO 的进化树Fig.9 Phylogenetic tree of ORCO protein in P. sinica with other insects