翟俊磊, 王美艳, 吴卓秋, 闵 遥, 向思琳, 高玉云, 王长康

(福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002)

随着肉鸡产业规模的日益扩大，在饲粮中添加油脂，可满足肉鸡的能量水平，是肉鸡饲养的关键[1].然而，1～21日龄肉鸡的消化道发育不完全，对脂类物质不能充分乳化，消化吸收率较低[2]，且机体自身分泌的胆汁不能完全分解所有脂肪，多余的脂肪会导致腹泻[3].研究表明：在饲粮中添加外源性乳化剂可缓解此类问题，有效改善肉鸡血清的生化指标，降低脂肪沉积，还可提高肉鸡的体重、采食量、料重比[4]；在饲粮中添加大豆磷脂可降低蛋鸡血清的低密度脂蛋白、胆固醇水平，提高高密度脂蛋白水平[5]；在饲粮中添加卵磷脂能显著降低肉鸡血清的总胆固醇水平，显著提高甘油三酯水平[6].上述研究表明，在饲粮中添加乳化剂能提高肉鸡的生产性能，降低脂类积累.大豆溶血磷脂(soybean lysophospholipid， SLPL)作为一种天然优质的乳化剂，进入畜禽消化道后仍能保持较强的乳化能力，有利于消化道中水包油型乳液的乳化[7-8].在家禽方面，有关SLPL对脂肪代谢消化吸收相关基因表达水平影响的研究报道较少.因此，本研究在日粮中添加不同含量的SLPL，探讨SLPL对肉鸡生长性能、血清生化指标、脂肪消化吸收基因表达水平的影响，为SLPL在肉鸡饲粮上的应用提供试验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

供试肉鸡为1日龄AA+白羽肉公鸡，体重(38.48±0.07)g，由福建龙岩宝泰农牧有限公司提供；SLPL(纯度≥85%)由麦伦(厦门)生物科技有限公司提供，载体为脱脂米糠.

1.2 试验设计

将288只供试肉鸡随机分为4组，每组6个重复，每个重复12只.CK饲喂基础日粮；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在基础日粮中分别添加100、200、300 mg·kg-1SLPL.基础日粮为玉米—豆粕型(添加4%豆油)，参考NY/T 33—2004[9]的方法配制而成.基础日粮组成及营养水平如表1所示.

表1 基础日粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient level of basal diets (air-dry basis)

1.3 饲养管理

试验在福建农林大学家禽试验场进行.供试肉鸡均采用笼养.试验前清洗鸡舍、料槽、料桶、饮水设备，铺垫料，用甲醛熏蒸48 h，开窗通风5 d后开始正式试验.入雏前24 h将鸡舍升温至32～35 ℃，此后根据每天的气温调整.采用连续光照、自然通风、自由采食和饮水、定期打扫鸡舍卫生、常规免疫程序进行饲养管理.

1.4 样品的采集与制备

供试鸡在21日龄时提前12 h断料供水，次日8:00以重复笼为单位称量鸡重.分别从每个重复组中选取2只体重中等的肉鸡，用真空采血管于翅静脉采血2 mL，倾斜静置，待血清渗出后，于3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，分装于EP管中，置于-20 ℃冻存.血液采集后立即颈部放血处死试验鸡，解剖后取肝脏、小肠组织先保存在液氮中，然后再转移到冰箱(-80 ℃)中保存，用于相关指标的测定.

1.5 指标的测定

1.5.1 生长性能 统计试验期间肉鸡的平均日增重[(平均期末体重-平均初始体重)/饲喂天数]、平均日采食量(平均阶段采食量/饲喂天数)、料重比(平均阶段采食量/平均阶段增重).

1.5.2 血清生化指标 血清生化指标采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，测定指标包括血清中载脂蛋白B(apolipoprotein B, ApoB)、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸、总胆固醇的水平.

1.5.3 脂肪消化吸收相关基因的表达水平 采用实时荧光定量PCR方法测定脂肪消化与吸收通路相关基因mRNA的表达水平，相关基因包括十二指肠和空肠的载脂蛋白A(apolipoprotein A,ApoA)、ApoB、乙酰辅酶A乙酰转移酶2(acetyl-CoA acetyltransferase 2,ACAT2)、二酰基甘油酰基转移酶2(diacylglycerol acyltransferase 2，DGAT2)基因及肝脏的乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，FAS)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase Ⅰ,CPT-1)基因.RNA采用RNAprep Pure Tissue Kit(北京天根生化科技有限公司)提取，然后用Eastep®RT Master Mix Kit(北京普洛麦格生物技术有限公司)对RNA进行反转录，所得的cDNA用Go Taq®qPCR Master Mix(北京普洛麦格生物技术有限公司)进行实时荧光定量PCR反应.内参基因和目的基因的上下游引物由福州擎科生物科技有限公司合成，引物序列如表2所示.实时荧光定量PCR反应结束后计算内参基因和目的基因的Ct值，采用2-△△Ct公式计算所选基因的相对表达量.

表2 内参基因、目的基因的引物序列Table 2 Primer sequences and amplification parameters of the reference gene and target genes

1.6 数据处理

数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，并进行LSD多重比较，结果以“平均值±标准差”表示.

2 结果与分析

2.1 SLPL对1～21日龄肉鸡生长性能的影响

由表3可知：Ⅱ、Ⅲ组1～21日龄肉鸡的平均日增重较CK分别提高5.3%、6.3%(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的料重比较CK分别下降2.1%(P>0.05)、6.2%(P>0.05)、7.5%(P<0.05).

表3 SLPL对1～21日龄肉鸡生长性能的影响1)Table 3 Effects of SLPL on growth performance of 1-21 days old broilers

2.2 SLPL对21日龄肉鸡血清生化指标的影响

由表4可知：Ⅱ、Ⅲ组21日龄肉鸡血清的ApoB含量较CK分别提高18.3%、20.7%(P<0.05)；Ⅲ组的高密度脂蛋白胆固醇浓度较CK提高15.2%(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的游离脂肪酸浓度较CK分别提高42.4%、44.9%、46.6%(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组低密度脂蛋白胆固醇浓度较CK分别下降8.2%(P>0.05)、13.7%(P>0.05)、20.5%(P<0.05).

表4 SLPL对21日龄肉鸡血清生化指标的影响1)Table 4 Effects of SLPL on serum indexes of 21 days old broilers

2.3 SLPL对21日龄肉鸡小肠脂肪消化吸收相关基因表达水平的影响

由表5、表6可知：Ⅱ、Ⅲ组21日龄肉鸡十二指肠ACAT2基因的表达水平较CK显著提高(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组空肠ACAT2基因的表达水平较CK显著提高(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组十二指肠DGAT2基因的表达水平较CK显著提高(P<0.05)，三组间空肠DGAT2基因表达水平的差异不显著(P>0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组十二指肠、空肠ApoA基因的表达水平较CK显著提高(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组十二指肠ApoB基因的表达水平较CK显著提高(P<0.05).

表5 SLPL对21日龄肉鸡十二指肠相关基因表达水平的影响1)Table 5 Effects of SLPL on the expressions of duodenal-related genes in 21 days old broilers

表6 SLPL对21日龄肉鸡空肠相关基因表达水平的影响1)Table 6 Effects of SLPL on the expressions of jejunum-related genes in 21 days old broilers

2.4 SLPL对21日龄肉鸡肝脏脂肪合成关键酶基因表达水平的影响

由表7可知：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组21日龄肉鸡肝脏AAC、FAS基因的表达水平较CK显著下降(P<0.05)；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肝脏CPT-1基因的表达水平较CK显著提高(P>0.05).

表7 SLPL对21日龄肉鸡肝脏相关基因表达水平的影响1)Table 7 Effects of SLPL on the expressions of liver-related genes in 21 days old broilers

3 讨论

3.1 SLPL对1～21日龄肉鸡生长性能的影响

乳化剂在畜禽饲料中的应用非常广泛，但SLPL作为乳化剂的一种，应用在肉鸡上的报道较少.Roy et al[4]研究表明，外源性乳化剂可提高肉鸡的体重、采食量、料重比；Melegy et al[10]研究表明，溶血卵磷脂通过提高饲料利用率，显著提高肉鸡的生长性能；Farman et al[11]研究表明，在日粮中添加0.1%大豆卵磷脂可提高肉鸡的生长性能，促进脂肪消化.上述研究结果与本研究结果一致.本研究结果表明，在日粮中添加200、300 mg·kg-1SLPL可显著提高肉鸡的平均日增重(P<0.05)，较CK分别提高了5.3%、6.3%.这可能与SLPL可以提高肉鸡肠道消化酶活性，促进消化道中脂肪的乳化有关.在日粮中添加SLPL可改善饲粮的适口性，促进饲粮中油脂的乳化，加强肉鸡对脂肪的消化吸收，从而提高生产性能.Xing et al[12]研究表明，溶血卵磷脂可提高仔猪断奶第15～35天以及整个断奶期间的平均日增重，但不影响平均日采食量、料重比.不同乳化剂对畜禽生长性能的影响不一致，可能与饲粮能量水平、脂肪来源、脂肪酸组成以及对脂肪消化吸收效率有关.

3.2 SLPL对21日龄肉鸡血清生化指标的影响

血清生化指标是反映动物机体代谢处于稳定状态的重要指标，尤其是肠道和肝脏的脂肪代谢[13].本研究结果表明，在日粮中添加SLPL可提高肉鸡血清的ApoB含量，此结果与杨丹丹等[14]的研究结果一致.杨丹丹等[14]研究表明，溶血卵磷脂、大豆油均可显著上调肉鸡肝脏ApoB基因mRNA的表达水平，从而提高血清的ApoB含量.肠道消化酶的活性与机体消化吸收能力密切相关，添加一定量的乳化剂可提高肉鸡肠道消化酶活性[15]，促进脂肪的消化吸收.SLPL可能通过提高消化酶活性来增强ApoB的转运，促进血脂代谢.Cho et al[16]研究表明，添加0.05%乳化剂(硬脂酰-2-乳酸钠)可降低肉鸡血清甘油三酯水平.刘梅等[17]研究表明，添加1%大豆磷脂可降低血浆甘油三酯水平，提高高密度脂蛋白水平.蔡元丽等[18]研究表明，肝脏中FAS基因mRNA表达水平的高低与甘油三酯水平呈正相关关系.本研究中，肉鸡血清甘油三酯浓度的下降，可能是由肝脏脂类代谢基因表达水平的下降引起.另有研究表明，当机体脂肪分解代谢加快时，大量的甘油三酯会分解为甘油、游离脂肪酸[19]，导致游离脂肪酸水平提高.低密度脂蛋白胆固醇的主要作用是将由肝脏合成的胆固醇转运到机体组织中，而高密度脂蛋白胆固醇的作用是将机体组织中的胆固醇运回至肝脏，产生代谢物排出.综上所述，SLPL能降低血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的水平，提高高密度脂蛋白水平，由此推断SLPL通过降低血清低密度脂蛋白胆固醇水平和提高高密度脂蛋白胆固醇水平来调节肉鸡总胆固醇代谢，可通过促进游离脂肪酸和ApoB的代谢，降低血管疾病的发生，从而影响机体脂质代谢过程，改善肉鸡的身体状况.

3.3 SLPL对21日龄肉鸡小肠脂肪消化吸收相关基因表达水平的影响

本研究结果表明，SLPL通过上调肉鸡小肠ACAT2、DGAT2、ApoA、ApoB基因mRNA的表达水平，促进脂肪的消化吸收，下调血液中甘油三酯、胆固醇的水平，降低脂肪沉积.

杨芳[20]在Caco-2细胞中发现脂肪酸通过上调ACAT2基因的转录表达水平，促进胆固醇转化为胆固醇酯，最终参与乳糜微粒的形成.本研究结果表明，SLPL通过上调肉鸡小肠ACAT2基因的表达水平，有效降低血液的胆固醇含量，阻止小肠对胆固醇的吸收，具有调节乳糜微粒的合成分泌作用[21].研究表明，DGAT2基因在畜禽甘油三酯的合成中起重要作用，对小肠吸收脂肪起关键作用[22];在饲粮中添加3%大豆磷脂，可提高蛋鸡ApoA、ApoB基因mRNA的表达水平[23].本研究结果表明，SLPL可上调小肠ACAT2、DGAT2、ApoA、ApoB基因mRNA的表达水平，但空肠的表达水平较十二指肠低，可能与脂肪消化吸收的主要部位在十二指肠有关.ApoA、ApoB作为载脂蛋白，主要在小肠合成，参与脂类物质合成乳糜微团，然后附着在乳糜微团上进行循环代谢.本研究中，ACAT2、DGAT2、ApoA、ApoB基因mRNA表达水平的提高，可能与共同参与胆固醇代谢、脂肪消化吸收有关.可见，小肠ACAT2、DGAT2基因mRNA表达水平的提高，可促进ApoA、ApoB基因mRNA表达水平的上调，共同参与脂肪转运，促进脂肪代谢，但具体机制还有待进一步研究.

3.4 SLPL对肉鸡肝脏脂类合成的影响

FAS、ACC作为脂肪酸合成酶，主要将碳水化合物转化为脂肪酸[24]，而CPT-1的主要功能是催化线粒体内膜外侧长链脂肪酸进入线粒体进行β氧化，其基因表达水平的提高有助于增强脂肪酸氧化[25].研究表明：FAS基因表达水平的下降,可减少肝脏脂类沉积,促进脂类氧化[26]；CPT-1基因表达水平的上调,可提高氧化效率,抑制肝脏脂肪合成基因(ACC、FAS)的表达[27-28].李岩等[29]研究表明,二十二碳六烯酸显著提高肉鸡肝脏组织CPT-1基因mRNA的表达水平,抑制FAS基因mRNA的表达.动物体内脂类的代谢主要通过机体自身协调控制脂类合成酶和分解酶的基因表达，而FAS、ACC、CPT-1是参与脂类代谢的关键酶.

本研究结果表明，SLPL可降低肉鸡肝脏FAS、ACC基因mRNA的表达水平，提高CPT-1基因mRNA的表达水平，且作用明显(P<0.05).Huang et al[30]研究表明，在饲粮中添加大豆油、大豆磷脂可提高白羽肉鸡的消化吸收能力，降低肝脏FAS、AAC的活性及脂肪的合成，此结果与本研究结果一致.但刘梅等[17]研究表明，随着磷脂添加量的增加，FAS、ACC基因的表达水平逐渐上调(P<0.05).FAS的活性及其基因表达水平受饲粮营养水平、生长激素的影响，在饲粮提供高能量的前提下，保证饲粮的高蛋白水平会抑制畜禽在肝脏中合成脂肪[18].Bell et al[31]研究表明，在小鼠中提供高能量饲粮能抑制FAS基因的表达.上述研究结果不一致可能与饲粮配方、饲养环境、机体激素的调节以及磷脂代谢途径不同有关.

本研究结果表明，在日粮中添加SLPL可下调肉鸡肝脏脂肪酸合成相关基因的表达水平，并上调CPT-1基因的表达水平，从而提高机体对脂肪的利用率，促进肉鸡生长，但ACC、FAS、CPT-1 3种脂类代谢基因相互作用的关系尚不清楚，可通过沉默某种基因来探究具体的作用机理.

4 结论

本研究结果表明：在日粮中添加SLPL可促进1～21日龄白羽肉鸡脂肪在机体的转运及降解，加快脂肪酸的分解，降低血脂指数，从而提高肉鸡的生产性能；SLPL可提高21日龄肉鸡小肠ACAT2、DGAT2、ApoA、ApoB基因mRNA的表达水平，加强甘油三酯的循环利用，促进肉鸡对脂肪的消化吸收；SLPL可降低21日龄肉鸡肝脏FAS、ACC基因mRNA的表达水平，提高CPT-1基因mRNA的表达水平.