张淑萍 张厚锋 孔娜 温海燕 周宛蓉 姜莉莉 樊兆斌*

（1，山东省菏泽市食品药品检验检测研究院 274000；2，菏泽学院药学院 274715）

半乳糖凝集素（Galectin）属于S 型凝集素，是一类不依赖钙离子的可溶性凝集素，在脊椎动物、无脊椎动物、原生动物和真菌等各种生物体内广泛存在。Galectin 结构上具有保守的糖识别结构域（CRD），对β-半乳糖苷具有广泛的亲和力，具有独特的结合位点和序列基序。通过与宿主细胞表面糖蛋白结合，对细胞生长、粘附、迁移和免疫反应等多种生物学功能产生影响[1]。β-半乳糖通过识别宿主细胞表面的糖蛋白发挥功能[2]。研究者对Galectin 的研究主要集中于其对参与先天和适应性免疫应答细胞的不同作用，以及其在免疫稳态中的调节作用机制。近些年，越来越多的研究结果表明，Galectin 还可以与潜在致病微生物、寄生虫和真菌表面的外源性聚糖结合，提示Galectin 在先天免疫中可以作为模式识别受体（PRRs）发挥作用，在宿主细胞发育和免疫反应调节过程中也有识别多糖的功能[3]。目前，哺乳动物半乳糖凝集素有15 个已被鉴定[4]。在人类半乳糖凝集素家族中，Galectin-1 是第一个被发现的成员，Galectin-1 属于同源二聚体的凝集素，存在于多种组织和细胞内，参与细胞的增殖、凋亡、粘附和炎症反应等多种生理过程，且与免疫系统的调节和肿瘤的发生发展密切相关[5]。研究表明，Galectin-1 参与多种病毒的生命活动，尼帕病毒感染内皮细胞后，Galectin-1 蛋白抑制病毒衣壳糖蛋白和宿主细胞之间的熔合并且通过树枝状细胞促进促炎症反应细胞活素的释放[6]。牙鲆受到病毒感染时，Galectin-1 能快速参与机体的抗病毒反应[7]。Galectin-1 能与流感病毒结合，改善病原的致病性[8]。Galectin-1 诱导HIV-1 感染T 细胞的凋亡与细胞表面糖蛋白的糖基化改变相关，细胞表面糖蛋白的唾液酸化增加，Galectin-1 诱导的细胞凋亡会被抑制，反之亦然[9]。本研究克隆梅花鹿Galectin-1 基因，并对其进行生物信息学分析预测，为进一步研究Galectin-1 编码蛋白功能提供有价值的参考资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

cDNA 第一链合成试剂盒、动物组织总RNA 提取试剂盒、2×Taq PCR Mastermix、D2000 DNA Marker、胶回收试剂盒、pGM-T 载体，质粒提取试剂盒、DH5α 感受态细胞等均购自天根公司；LB 培养基，购自Solarbio 公司；BamH I 与Xho I 购自Thermo Fisher 公司。

1.2 试验样品

梅花鹿肝脏组织。

1.3 引物设计

根据ncbi 数据库中已发表的梅花鹿Galectin-1 mRNA 序列（登录号MG882483.1），设计合成梅花鹿Galectin-1 基因扩增引物Gal-1F/Gal-1R。Gal-1F:5'-CGCGGATCCATGGCTTGTGGTCTGGTCGCC-3'，Gal-1R:5'-CCGCTCGAGTCACTCAAAGGCCACACACTT-3'，上下游引物分别引入BamH I 与Xho I 酶切位点，引物由华大基因有限公司合成。

1.4 梅花鹿Galectin 1 基因PCR 扩增

提取梅花鹿肝脏组织RNA，反转录为cDNA，以其为模板，用引物Gal-1F/Gal-1R 进行PCR 扩增。PCR 反应体系:cDNA1μL，上游引物2μL，下游引物2μL，2×TaqPCRMaster-Mix25μL，ddH2O20μL，共50μL。PCR 反应程序：94℃预计变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35 个循环；最后，经72℃延伸10min 后4℃保存。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，后进行胶回收。

1.5 PCR 产物连接、转化及测序

将胶回收产物16℃条件下过夜连接pGM-T 载体，连接产物转化DH5α 感受态细胞，涂布LB （A+抗性）固体培养基，37℃培养过夜。挑取单个圆滑白色菌落于4mLLB （A+抗性）液体培养基，于37℃条件下180rpm 摇菌培养16h，后用质粒提取试剂盒提取质粒。经PCR 筛选阳性重组质粒，选取3 个阳性克隆送华大基因公司进行序列测定。

1.6 Galectin-1 编码蛋白理化特性及生物信息学分析

使用ProtParam 在线工具对Galectin-1 编码蛋白理化特性进行预测分析。利用Protscale、TMHMM2.0 等在线软件分析Galectin-1 翻译氨基酸序列的疏水性、跨膜结构。采用SignalP-5.0Server 预测蛋白信号肽，利用NetPhos3.1Server，NetOGlyc4.0和NetNGlyc1.0 进行潜在磷酸化位点及潜在O、N 糖基化位点预测。利用在线分析软件 （http://Imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）进行抗原决定簇预测。

2 试验结果

2.1 Galectin-1 基因PCR 扩增

PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，扩增目的基因片段在400bp 左右，与预期结果一致。

图1 Galectin 1 基因PCR 扩增结果

2.2 Galectin-1 基因核苷酸序列分析

用DNA Star 软件对梅花鹿Galectin 1 基因测序进行分析，结果表明，梅花鹿Galectin-1 基因的编码区全长408bp，编码135 个氨基酸。A （22.06%）、T （21.32%）、G （28.92%）、C（27.7%），其中鸟嘌呤 （G）含量最高，且 （G+C）%为56.62%，提示Galectin1 蛋白为稳定蛋白。

2.3 Galectin 1 基因编码蛋白理化特性及生物信息学分析

使用在线工具ProtParam 对Galectin-1 编码蛋白序列分析，结果表明梅花鹿Galectin-1 编码蛋白理论分子量为14.69 kD，分子化学式为C650H1004N178O197S7，理论等电点为5.1，不稳定系数为14.87，推测该蛋白为稳定蛋白。哺乳动物网织红细胞中半衰期为30h，脂肪系数为81.04。利用ExPASy ProtScal 程序，对Galectin-1 基因编码产物的亲/疏水性分析，其疏水性图谱如图2 所示，整个多肽链有4 个明显的亲水区；该氨基酸序列内超过半数为亲水性残基，整条多肽链表现为亲水性，总平均亲水指数为-0.145。

图2 Galectin-1 编码蛋白亲/疏水性预测

利用在线跨膜区结构预测软件TMHMM2.0 进行Galectin-1编码蛋白序列跨膜区分析，结果表明，该蛋白不含跨膜区，均为胞外区。信号肽预测结果显示，Galectin-1 编码蛋白不含信号肽。潜在磷酸化位点预测结果表明，阈值0.5 时，Galectin-1编码蛋白存在1 个潜在的磷酸化位点，位于肽链的第98 位的苏氨酸（图3）。利用软件NetOGlyc 4.0 和NetNGlyc 1.0 进行潜在O、N 糖基化位点预测，结果显示Galectin-1 编码蛋白不存在潜在的O-糖基化和N-糖基化修饰位点。

图3 Galectin-1 编码蛋白磷酸化位点预测结果

抗原决定簇预测结果表明，Galectin-1 编码蛋白平均抗原倾向指数为1.0297，如图4 所示，共含有7 个抗原决定簇区域，分别位于4～10，13～22，24～33，40～46，56～62，76～91 及114～123 位氨基酸残基。表明Galectin-1 编码蛋白含有较多的优势抗原表位结构，抗原倾向指数高。

3 讨论

图4 Galectin 1 编码蛋白抗原决定簇预测结果

Galectin-1 是一种与β-半乳糖苷结合的哺乳动物凝集素，参与了许多信号通路和与癌症及免疫紊乱相关的免疫反应[10]。早期对Galectin 生物学功能的认识仅局限于在胚胎发生和早期发育中的内源性碳水化合物配体的识别，后来随着其在脂肪形成、组织修复、癌症和调节免疫稳态中作用的发现，其生物学作用显著扩大[11]。近些年，越来越多的证据表明，Galectin 可以结合潜在致病微生物表面的聚糖，在先天免疫中发挥识别和效应因子作用。Galectin 不仅可以作为模式识别受体，还可以作为效应因子，通过与微生物表面结合并抑制粘附和/或进入宿主细胞，通过破坏病原体表面结构，或通过促进吞噬、包埋、自噬和清除循环中的病原体直接杀死潜在病原体[12]。同时，一些病毒或细菌也可以利用Galectin 的识别作用，成功地附着和入侵宿主细胞。

Galectin 调控的先天免疫识别和效应器机制，虽然仍能预防或抵抗病毒、细菌和寄生虫感染，但需要通过其表面糖蛋白的独特进化以适应进入宿主，并获得有效的机制来逃避宿主的免疫应答[12]。通过调节细胞凋亡、血管生成、迁移、细胞免疫逃逸等多种生物学功能抑制Galectin，在肿瘤发生和转移过程中发挥着重要作用，已被认为是癌症治疗的潜在治疗手段之一[13]。Galectin 也被认为是癌症诊断、预后和治疗情况的生物标志物。研究表明，Galectin 极大地加速了HIV-1 与易感细胞的结合动力学，通过特异性结合CD4 细胞，导致病毒入侵更为迅速，病毒复制更为强劲。因此，Galectin 被认为是用于开发新的治疗癌症和艾滋病药物的一种有前途的分子靶点[13]。

Galectin-1 以依赖乳糖的方式促进病毒粒子结合和靶细胞感染，提示Galectin-1 是在HIV-1 发病机制中发挥重要功能的宿主因子，能加强或促进HIV-1 与易感细胞的关键相互作用[14]。HIV-1 利用宿主聚糖结合蛋白Galectin-1 增加其对宿主细胞的附着，从而增加其在易感细胞中的传染性。在HIV-1 感染的细胞模型中具有特异抑制Galectin-1 活性的主要化合物，Galectin-1 可降低抗HIV-1 药物靶向病毒早期复制的效率，因此，Galectin-1 特异性抑制剂可作为治疗HIV-1 感染的一类新的化合物[15]。本研究克隆梅花鹿Galectin-1 基因，并对其进行生物信息学分析预测，为进一步研究Galectin-1 编码蛋白功能提供有价值的参考资料。