许青，徐昕，公丽艳，张叶帆，杨平

沈阳师范大学（沈阳 110034）

钙参与人体内细胞内代谢、凝血、神经传导、骨骼生长等重要功能[1]，是维持人类健康的重要矿物质。钙在偏碱性环境下的肠道溶解性不好，生物可利用率较低。通常食用的谷物中钙含量难以达到3.3%的推荐摄入量[2]。低聚肽作为一种易吸收、高容量的协同转运载体[3]，具有吸收利用率高、排泄率低、消化稳定性好、毒性低等特点[4]。由于低聚肽有独立的转运系统，能携钙转运，不仅有利于肽和钙2种营养素吸收，还可防止补钙造成的高钙血症[5]。研究发现，三文鱼骨胶原[6]、大豆蛋白水解产物[7]、蛋清酶肽[8]等都具有较高钙结合活性，能促进体内钙的吸收和利用。利用食品工业的副产品生产钙结合肽成为研究热点。

淡水鱼加工产生的鱼皮、鱼骨、鱼鳞等副产物的利用是淡水鱼加工业关注的问题之一，草鱼是淡水鱼中常见的种类，鱼鳞中含有丰富胶原蛋白（占鱼鳞的50%～70%）。然而，鱼鳞中Ⅰ型胶原主要分布在鱼鳞内层，外层被羟基磷灰石覆盖，这些抗性屏障使得鱼鳞在加工过程中不易捣碎，故多被用作饲料、生产鱼粉或直接丢弃，而用于制备生物活性肽的研究报道较少。试验以草鱼鳞为原料，采用双酶协同酶解，响应面优化酶解胶原蛋白钙结合肽的最佳工艺条件，制备出高活性钙结合肽，为利用草鱼加工副产物，提高其附加值，开发补钙产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草鱼鳞，经冷水洗净后，保存于-18 ℃下备用。

复合蛋白酶（1.5 AU/g）、中性蛋白酶（0.8 AU/g）、碱性蛋白酶（2.4 AU/g）和风味蛋白酶（500 LAPU/g）（丹麦Novozymes公司）；其余试剂均为国产分析纯。

HH-6型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；BCD-198型冰箱（博西华家用电器有限公司）；X-12R型高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；Scientz-12N型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SHA-B水浴恒温振荡器（上海力辰仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 胶原蛋白钙结合肽的制备方法

新鲜鱼鳞洗净、绞碎→按料液比1∶10（g/mL）加入0.5 mol/L乙酸溶液，于50 ℃提取24 h→8 000 r/min离心20 min→取沉淀→冻干→加磷酸缓冲溶液→酶解2 h→100 ℃灭酶10 min→10 000 r/min离心30 min取上清液→超滤膜超滤（截留分子质量为1 000 Da）→冻干→-18 ℃下储存备用

1.2.2 水解度的测定

蛋白酶解水解度（DH）的测定采用pH-stat法[9]。

1.2.3 钙结合率的测定

将5 mmol/L CaCl2和20 mmol/L pH 7.8磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙沉淀，加入制备的低聚肽，37 ℃恒温振荡2 h，以10 000 r/min离心15 min，邻甲酚酞络合酮比色法[10]测定上清液可溶性钙结合率。

1.2.4 蛋白酶的筛选

选取复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶4种蛋白酶，在酶推荐的条件下酶解3 h，酶解条件见表1。取0.1 g提取的胶原蛋白，依次加入10mL磷酸缓冲溶液、10 mg蛋白酶，以钙结合率和DH为指标，筛选试验用酶。

表1 不同蛋白酶水解试验条件

1.2.5 单因素试验

以钙结合率和水解度为指标，分别考察复合蛋白酶与风味蛋白酶质量比（1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2和9∶1）、酶解时间（1，2，3，4，5和6 h）、pH（6.0，6.5，7.0，7.5和8.0）、酶解温度（25，30，35，40，45和50 ℃）、底物浓度（1，5，10，15和20 g/L）5个因素对钙结合率和DH的影响。

1.2.6 响应面优化钙结合肽的试验

根据中心组合设计原理，以钙结合率和DH为响应值，选择复合蛋白酶与风味蛋白酶质量比、酶解温度、酶解时间为自变量，进行三因素三水平的响应面优化试验。

1.2.7 数据分析

采用Design-Expert 10软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

由表2可见，4种蛋白酶的酶解产物均有一定钙结合能力，复合蛋白酶酶解产物的钙结合率和DH最高，其次是中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶。复合蛋白酶和中性蛋白酶的水解条件接近，适合同步双酶解，因此选择复合蛋白酶和中性蛋白酶对鱼鳞胶原蛋白协同酶解。

2.2 酶解条件的单因素试验结果

2.2.1 复合蛋白酶与中性蛋白酶质量比对酶解反应的影响

由图1所示，复合蛋白酶与中性蛋白酶质量比6∶4时，胶原蛋白的DH最高，达到20.31%，酶质量比5∶5时，钙结合率最为19.01%。不同蛋白酶的特异酶切位点不同，酶解产物有所不同[11]。双酶协同酶解时由于增加水解的主要位点，相对于单酶解，可获得更多的钙结合位点，提高DH和短肽率。因此，选取复合蛋白酶与中性蛋白酶质量比5∶5。

表2 蛋白酶对胶原蛋白酶解效果的影响

图1 酶质量比对钙结合肽DH和钙结合率的影响

2.2.2 底物浓度对酶解反应的影响

由图2所示，随着底物浓度增大，可溶性钙结合率和DH先增加后降低，底物质量浓度15 g/L时达到最大，底物质量浓度继续增加到20 g/L时可溶性钙结合率和DH均明显下降。底物质量浓度较低时，底物可与酶充分接触，随着底物质量浓度继续增加，胶原蛋白逐渐成凝胶状态，影响钙与肽的充分接触，致使肽与钙结合率降低。因此，选取胶原蛋白酶解底物质量浓度15 g/L。

图2 底物质量浓度对钙结合肽DH和钙结合率的影响

2.2.3 酶解pH对酶解反应的影响

由图3可知，在pH 5.5～7.5范围内，pH对钙结合率和DH的影响差异不显著（p＞0.05），pH 7时钙结合率和DH达到最大值，分别为28.2%和25.58%。因此，选取酶解pH 7。

2.2.4 酶解温度对酶解反应的影响

由图4可知，酶解温度40～65 ℃时，随着酶解温度升高钙结合率和DH均先升后降，酶解温度55 ℃时达到最高值，酶解温度大于55 ℃时钙结合率和DH都明显下降（p＜0.05）。温度是影响酶促反应的一个重要因素，酶解温度超过该酶的最适反应温度时，酶会出现不同程度变性，降低反应速率。因此，选取酶解反应温度50 ℃。

图3 酶解pH对钙结合肽DH和钙结合率的影响

图4 酶解温度对钙结合肽DH和钙结合率的影响

2.2.5 酶解时间对酶解反应的影响

由图5可知，随着酶解时间的延长，钙结合率和DH不断提高，酶解4 h钙结合率和DH达到最大值，分别为28.37%和30.23%；水解时间3和4 h的钙结合率和DH差异不显著（p＞0.05），因此，选取酶解时间3 h。

图5 酶解时间对钙结合肽DH和钙结合率的影响

2.3 响应面优化胶原蛋白钙结合肽酶解的结果

2.3.1 响应面优化试验方案及结果

根据单因素试验结果，选择双酶质量比、酶解温度、酶解时间为自变量，以胶原蛋白钙结合肽的钙结合率和DH为响应值，进行三因素三水平Box-Behnken响应面试验，具体设计方案及结果如表3所示。

表3 胶原蛋白钙结合肽响应面优化试验方案及结果

2.3.2 模型方程的建立及显著性分析

肽结合钙率的二次回归模型显著性分析如表4所示，肽钙结合率与各因素的响应函数（回归方程）为Y=32.76+2.51A-2.81B+1.79C+4.43AB-3.64AC-1.49BC-9.2A2-3.03B2-4.31C2（Y，指钙结合率；A、B、C分别代表双酶质量比、底物浓度、酶解温度），回归模型的F=34.30，达到极显著水平（p＜0.01），失拟项F=4.62，不显著（p＞0.05），说明钙结合率的模型建立良好。水解度的二次回归模型显著性分析如表5所示，水解度与各因素的响应函数（回归方程）为Y=48.83+2.07A-4.35B+5.47C+2.38AB-6.80AC-1.78BC-11.45A2-3.51B2-5.54C2。回归模型的F=293.98，达到极显著水平（p＜0.01），失拟项F=0.33，不显著（p＞0.05），说明肽水解度的模型建立良好。

表4 钙结合率的二次回归方程方差分析结果

表5 水解度的二次回归方程方差分析结果

2.3.3 响应面的交互效应分析

图6显示以钙结合率和DH为响应值的趋势图。响应面图弯曲程度，可反映因素间交互作用对钙结合率的影响程度，弯曲程度越高，说明2个因素的作用越显著。可以看出，酶质量比、底物质量浓度及温度之间的交互作用均显著（p＜0.05），肽的钙结合率在3个因素均适宜情况下才会达到最大值。

图6 各因素交互作用对钙结合肽钙结合率和DH的影响

2.4 验证试验结果

为获得钙结合能力强的低聚肽，以钙结合率为响应值，分析得出影响因素的最佳组合为复合蛋白酶与风味蛋白酶质量比6∶4、底物质量浓度18.75 g/L、酶解温度51.5 ℃，预测钙结合率为33.43%。为检验模型预测的准确性，在该酶解条件下试验测得钙结合率为32.93%±0.84%，与预测值接近。

3 结论

酶解技术在鱼副产品加工的应用越来越广泛，试验以草鱼鳞为原料，采用复合蛋白酶与中性蛋白酶协同酶解钙结合肽，建立以钙结合率为响应值，以酶质量比、底物浓度及水解温度为自变量的数学模型，得到复合蛋白酶与风味蛋白酶质量比6∶4、底物质量浓度18.75 g/L、酶解温度51.5 ℃条件下，此酶解条件下的低聚肽钙结合率为33.43%。试验利用双酶解制备鱼鳞胶原蛋白钙结合肽，获得有较高钙结合能力的低聚肽酶解工艺，可为草鱼加工副产品的深加工提供理论依据。