邸松，戴鹂莹，钟方丽，王晓林

吉林化工学院化学与制药工程学院（吉林 132022）

刺玫果（Rosa davuricaPall.）系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫成熟果实，广泛分布在黑龙江、吉林、辽宁等地[1]，富含黄酮、多糖、鞣质等成分，具有抗氧化、抗疲劳、保肝等作用[2]。刺五加（Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms）含有皂苷、多糖、氨基酸等有效成分，具有较强的抗疲劳和增强免疫力的功能[3]。人参皂苷为人参（Panax ginsengC. A.MeY.）的主要活性成分[4]，有研究表明，人参皂苷能有效缓解机体疲劳[5]。三者均为东北道地食药同源中药材[6]。其中，人参、刺五加作为吉林省中药材种植产业的重要组成部分，被广泛种植在长白山地区[7]。试验以东北地产刺玫果、人参、刺五加为原料，充分利用3种植物均具有较强抗疲劳功能的优势，经醇提、纯化得到双刺参总皂苷，研究开发保健功能为抗疲劳的中药类保健食品——双刺参胶囊，为东北地产中药材资源的充分利用提供科学依据。

随着中国文化在世界的推广，中医药逐渐受到全世界越来越多人关注[8]。但中药复方类制剂因为服用剂量大、药物颜色较深、成剂体积较大、不方便食用等因素，影响其在临床应用，阻碍中药复方制剂进入国际市场的脚步[9]。近年来，为有效改善中药制剂缺点，达到去粗取精、富集活性成分的目的，中药提取物的纯化工艺不断发展，逐渐成熟[10]。大孔树脂的吸附-解吸法是常见的纯化方式[11]。大孔树脂是一种集吸附、筛选原理于一体，不溶于酸、碱、有机溶剂的高分子聚合物吸附剂[12]，其具有较大比表面积，可对中药复方中的活性成分进行吸附，且吸附物质经溶剂洗脱较为容易，能有效对中药复方中的有效成分进行富集、纯化[13]。

试验采用大孔树脂，通过单因素试验及正交试验，探索双刺参提取物中总皂苷纯化的最优工艺条件。并对双刺参胶囊的体外抗肿瘤活性进行考察，为其进一步研究及开发提供基础数据，为东北中药种植产业发展提供思路。

1 试剂与方法

1.1 材料与试剂

刺玫果、刺五加、人参（中药饮片，吉林国安药业有限公司）；大孔吸附树脂（LSA-10、AB-8、LX-19、LX-8、LSA-21、D-101、LX-36型，西安蓝晓科技新材料股份有限公司）；香草醛（天津市光复精细化工研究所）；无水乙醇（天津市永大化学试剂有限公司）；浓硫酸（天津市北方天医化学试剂有限公司）；α-萘胺（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；盐酸萘乙二胺（分析纯，天津市化学试剂研究所有限公司）。

1.2 仪器与设备

恒温水浴振荡器（SHA-B型，金坛市科析仪器有限公司）；紫外分光光度计（TU-1950型，北京普析通用仪器有限责任公司）；超声波清洗器（KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 双刺参总皂苷溶液的配制

按处方量称取刺玫果粉、刺五加粉、人参粉，混合均匀后，加入5倍量90%乙醇，于80 ℃水浴提取2次，每次1 h，过滤，滤液合并，在60 ℃条件下减压浓缩、干燥，得到双刺参总皂苷提取物。称取适量总皂苷提取物，以水为溶剂经超声处理，即得供试品溶液。

1.4 总皂苷的含量测定

采用香草醛-乙醇-浓硫酸法[14]进行显色，吸取0.5 mL供试品溶液，于80 ℃水浴蒸干溶剂，加入0.5 mL 8%香草醛-乙醇溶液，加入72%浓硫酸混合均匀，于60 ℃水浴15 min，室温放置15 min，于540 nm测定吸光度，代入标准曲线方程（y=23.01x+0.057 7，R2=0.999 4）计算总皂苷含量。

1.5 总皂苷的纯化工艺研究

1.5.1 大孔树脂的筛选

选用LSA-10、AB-8、LX-19、LX-8、LSA-21、D-101、LX-36型大孔树脂，参考文献[15]的方法对树脂进行处理。称取2.0 g树脂，加入30 mL总皂苷质量浓度为2 mg/mL供试品溶液，室温振荡吸附2 h，静置24 h，充分吸附后进行抽滤，取适量滤液，于540 nm测定其吸光度，计算其对总皂苷的吸附率。树脂中加入50 mL 80%乙醇，室温振荡2 h进行解吸。解吸后吸取适量上清液，于540 nm测定其吸光度，计算其对总皂苷的解吸率，筛选出3种吸附-解吸效果较好的树脂进行后续试验。

式中：C0为原液中总皂苷的质量浓度，mg/mL；C1为吸附后溶液中总皂苷质量浓度，mg/mL；C2为解吸液中总皂苷质量浓度，mg/mL；V1为吸附液体积，mL；V2为解吸液体积，mL。

1.5.2 大孔树脂静态吸附及解吸动力学考察

根据树脂筛选试验结果，称取效果较好的3种树脂，每种7份，每份2.0 g，置于100 mL锥形瓶中，分别加入30 mL总皂苷质量浓度2 mg/mL供试品溶液，室温下分别吸附1，2，3，4，5，6和7 h，取适量上清液，于540 nm测定其吸光度，计算其对总皂苷的吸附率，以吸附时间为横坐标，吸附率为纵坐标，绘制静态吸附动力学曲线。

3种树脂各取7份，每份2.0 g，置于100 mL锥形瓶中，加入30 mL总皂苷质量浓度2 mg/mL供试品溶液，室温振荡吸附2 h，静置12 h后抽滤，各加入50 mL 80%乙醇，分别解吸10，20，30，60，120，180和240min，取适量解吸液，于540 nm测定其吸光度，计算其对总皂苷的解吸率，以解吸时间为横坐标，解吸率为纵坐标，绘制静态解吸动力学曲线。

1.5.3 单因素试验

根据树脂选择的结果，称取若干份D-101大孔树脂（2 g/份），分别考察供试品溶液pH（pH 1，2，3，4，5，6，7，8和9）、供试品溶液总皂苷质量浓度（1，2，3，4，5和6 mg/mL）、供试品溶液加入量（5，10，15，20，25和30倍）、乙醇体积分数（0，10%，30%，50%，70%和90%）及解吸液加入量（5，10，15，20，25和30倍）5个因素对吸附率及解吸率的影响。

1.5.4 正交试验法优化总皂苷纯化工艺

根据单因素试验结果，选取供试品溶液加入量、供试品溶液总皂苷质量浓度、解吸液乙醇体积分数及解吸液体积4个对纯化影响较大的因素，建立四因素三水平正交试验，因素水平表见表1。

表1 正交因素水平表

1.5.5 工艺验证试验及总皂苷的含量测定

根据正交试验结果，称取10.0 g D-101型大孔树脂，共3份，按照最优工艺进行纯化试验，计算吸附率、解吸率及δRSD。合并3次工艺验证性试验的解吸液，于60 ℃浓缩至稠膏状，减压干燥，得到总皂苷纯化物。取1.0 g纯化物，加入30 mL甲醇，超声处理30 min后过滤，滤渣经甲醇洗涤2次，合并滤液及洗涤液，定容至50 mL。吸取适量上液，按显色方法进行显色、测定吸光度，计算干浸膏中总皂苷的含量。

式中：C为溶液中总皂苷浓度，mg/mL；M为纯化物质量，g。

1.6 双刺参总皂苷的体外抗肿瘤活性研究

1.6.1 清除亚硝酸盐活性

在15 mL模拟胃液（pH 3.0）中加入2 mL双刺参总皂苷供试品溶液，混合，加入2.5 mL 10 μg/mL亚硝酸钠溶液，于37 ℃恒温水浴反应30 min，取出后立即加入0.5 mL 0.4%对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置15 min后加入0.25 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液及7 mL蒸馏水，混合均匀，放置15 min[16]。于538 nm波长处测定吸光度Ai；取2 mL供试品溶液，其余各液由60%乙醇替代同法操作测定Aj；以60%乙醇替代供试品溶液，同法操作测得A0，按式（4）计算清除率。

1.6.2 阻断亚硝胺合成的活性

参考文献[17]的方法。取2.0 mL pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，加入2.0 mmol/L亚硝酸钠溶液、2.0 mmol/L二甲胺溶液各0.6 mL、各供试品溶液1.0 mL，混合均匀，加入1.5 mL蒸馏水，于37 ℃水浴恒温反应1 h，用移液管吸取1.0 mL溶液，加到直径7 cm的培养皿中，加入0.5 mL 0.5%碳酸钠溶液，在254 nm紫外灯下照射15 min，取出，分别加入1.5 mL 1%对氨基苯磺酸溶液、0.5 mL 0.1%α-萘胺溶液和0.5 mL蒸馏水，摇匀，放置15 min，用紫外分光光度计在525 nm处分别测定吸光度AX；以60%乙醇替代供试品溶液同上操作测定A0，按式（5）计算清除率。

2 结果与讨论

2.1 单因素考察结果

2.1.1 大孔树脂的筛选

通过对7种大孔树脂静态吸附率及解吸率的测定，绘制出图1。LSA-10、AB-8及D-101这3种大孔树脂的吸附率与解吸率均较高，可有效对双刺参总皂苷进行富集纯化，所以选择3种树脂进行吸附动力学及解吸动力学考察。

图1 大孔树脂对皂苷吸附率及解吸率比较

2.1.2 大孔树脂静态吸附及解吸动力学曲线的绘制

通过对不同吸附时间及解吸时间下，大孔树脂对总皂苷吸附率与解吸率的测定，分别绘制大孔树脂静态吸附动力学曲线（图2）和大孔树脂静态解吸动力学曲线（图3）。根据测定结果，以吸附率与解吸率的乘积作为纯化能力考察指标，3种树脂中D-101型与LSA-10型2种大孔树脂静态吸附4 h后，吸附率基本不变，且两者吸附率相当，AB-8型大孔树脂静态吸附3 h后，吸附率基本不变，但其吸附率小于D-101型和LSA-10型大孔树脂。D-101、AB-8型大孔树脂静态解吸30 min后，解吸率达到最高，而LSA-10型大孔树脂需要解吸1 h后，解吸率基本不变。通过比较解吸率，D-101型大孔树脂的解吸率95%以上，相比较于其他2种树脂，解吸效果较好。以吸附率与解吸率的乘积为考察指标，3种树脂的纯化能力由强到弱的顺序为D-101＞LSA-10＞AB-8，其吸附时间4 h，解吸时间30 min。故选择D-101进行后续试验。

图2 大孔树脂静态吸附动力学考察

图3 大孔树脂静态解吸动力学考察

2.1.3 pH对吸附率的影响

从图4中可以看出，溶液pH 1～4时，树脂对双刺参总皂苷的吸附率变化不大，pH＞4时，大孔树脂对总皂苷的吸附率逐渐下降。经过测定，双刺参总皂苷溶液的pH 4.0±0.2，所以无需对供试品溶液的pH进行调节。

2.1.4 供试品溶液中总皂苷质量浓度对吸附率的影响

通过大孔树脂对总皂苷质量浓度不同的供试品溶液的吸附率进行测定，结果表明，随总皂苷质量浓度增加而下降，总皂苷质量浓度为1 mg/mL时，吸附率最大。分析其原因，总皂苷质量浓度低，有利大孔树脂对有效成分富集，质量浓度升高后，其富集能力下降，但总皂苷质量浓度过低，生产效率低下。故选择质量浓度1 mg/mL进行后续试验，试验结果如图5所示。

图4 pH对大孔树脂吸附率的影响

图5 总皂苷溶液质量浓度对吸附率的影响

2.1.5 供试品溶液加入量对吸附率的影响

由图6可以看出，大孔树脂对总皂苷的吸附效果，随供试品溶液用量增加而逐渐减弱。料液比为1∶5（g/mL）时，吸附率最高，为78.23%，料液比为1∶10（g/mL）时，虽然略有下降，但变化不大，从经济角度考虑，后续试验选择料液比1∶10（g/mL）进行。

图6 总皂苷溶液用量对吸附率的影响

2.1.6 解吸液乙醇体积分数对解吸率的影响

根据试验测定结果，以乙醇体积分数为横坐标，解吸率为纵坐标绘制图7。乙醇体积分数0～70%，随着乙醇体积分数递增，总皂苷解吸率逐渐增加。乙醇体积分数超过70%后，继续增加乙醇体积分数，解吸率变化不大，故选择70%乙醇进行后续试验。

图7 乙醇体积分数对解吸率的影响

2.1.7 解吸液加入量对解吸率的影响

根据图8可以看出，总皂苷的解吸率随着解吸液加入量增加而增加，解吸液加入量大于25倍时，解吸率虽然有所增加，但整体变化不大。

图8 解吸液加入量对解吸率的影响

2.2 正交试验结果

根据表2分析可知，4种因素对总皂苷纯化的影响较大的乙醇体积分数（C），其次为供试品溶液加入量（A），供试品溶液总皂苷质量浓度（B）与解吸液加入量（D）影响程度相当，最优工艺条件为A1C3B1D1，即加入7倍量总皂苷质量浓度1 mg/mL供试品溶液，室温振荡吸附4 h后抽滤，加入22倍量75%乙醇，室温解吸30 min。

表2 正交试验结果分析表

2.3 工艺验证试验及总皂苷含量测定的结果

称取10.0 g D-101型大孔树脂，共3份，置于250 mL锥形瓶中，分别加入7倍量，总皂苷质量浓度1 mg/mL的供试品溶液，室温下振荡吸附4 h，抽滤，测定吸附率。向容器中加入22倍量75%乙醇，室温振荡解吸30 min，取适量上清液，测定解吸率。结果表明，3次试验的吸附率分别为83.01%，83.51%和82.84%，平均吸附率为83.12%，δRSD为0.42%；解吸率分别为98.60%，99.27%和98.80%；平均解吸率为98.89%，其δRSD为0.35%，说明该工艺稳定、纯化总皂苷的效率高，可用于双刺参总皂苷的纯化。

经过测定，干浸膏中总皂苷的含量由纯化前的17.83%提高到37.04%，提高2.08倍。结果表明D-101型大孔树脂静态吸附-解吸法能有效纯化双刺参总皂苷。

2.4 体外抗肿瘤活性的测定结果

从图9和图10可以看出，双刺参提取物清除亚硝酸盐活性、阻断亚硝胺合成活性与其质量浓度呈正相关趋势。通过对供试品溶液质量浓度及其清除率的拟合，分别得到清除亚硝酸盐活性的拟合方程为y=11.636x-43.526（R2=0.970 5），阻断亚硝胺活性的拟合方程为y=1.622 6x+36.937（R2=0.969 9）。经过计算，双刺参提取物清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成活性的半数抑制质量浓度分别为0.56 mg/mL和8.05 μg/mL，表明双刺参胶囊具有一定体外抗肿瘤活性。

图9 总皂苷清除亚硝酸盐活性

图10 总皂苷阻断亚硝胺合成活性

3 结论

通过静态吸附-解吸试验、静态吸附及解吸动力学试验，考察7种大孔树脂对双刺参总皂苷的纯化效果，采用单因素试验及正交试验，对D-101型大孔树脂纯化双刺参总皂苷的工艺条件进行优化。结果表明，D-101型大孔树脂对双刺参总皂苷具有较好的纯化效果，最优纯化工艺为D-101型大孔树脂中加入7倍量，总皂苷质量浓度1 mg/mL供试液，室温振荡吸附4 h，以22倍量75%乙醇振荡解吸30 min。在此工艺条件下，双刺参总皂苷的吸附率为83.12%，解吸率为98.80%，纯化后干浸膏中的总皂苷含量由17.83%提高到37.04%。

体外抗肿瘤活性试验中，双刺参提取物清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺活性的IC50值分别为0.56 mg/mL和8.05 μg/mL，表明双刺参提取物具有一定体外抗肿瘤活性。试验结果为双刺参胶囊的进一步开发奠定数据基础。