王蝉娟 徐成龙, 马 俊 那定勋 张饮江,

(1.上海海洋大学海洋生态与环境学院, 上海 201306; 2.水域环境生态上海高校工程研究中心, 上海 201306)

福寿螺(Pomacea canaliculataLam)别名大瓶螺、苹果螺, 属于中腹足目瓶螺科。原产南美洲亚马逊河流域, 因其蛋白质含量丰富, 营养成分高,20世纪80年代被作为一种水生经济动物引入我国南方[1], 后因过度盲目养殖, 腥味太浓、食味不佳等原因被大量弃于田野, 并通过水渠河道迅速扩散到稻田等水生环境。由于其繁殖力、适应性和抗逆性强, 食性杂, 缺乏天敌等多个原因, 现今福寿螺已在我国南方许多地区暴发成灾, 对入侵地的生物多样性、生态系统、农作物及多种水生植物构成重大威胁[2]。此外, 福寿螺是引起人类嗜酸性脑膜炎的广州管圆线虫的中间宿主[3], 对人类的健康具有间接的潜在危害。2000年IUCN外来入侵物种专家委员会将福寿螺列为世界100种恶性外来入侵物种之一[4], 2003年3月, 国家环保总局将福寿螺列入首批入侵中国的16种外来物种“黑名单”[5]。目前, 福寿螺防治方法主要包括化学防治、农业防治和生物防治等[6], 不同方法各存有不足, 其中生物控制技术因具有长效、经济、对非靶细胞更生态安全等优点, 成为当前控螺领域的研究热点, 但有关植物源毒杀剂的提取制备和针对福寿螺的毒杀效果研究相对较少, 且未能深入探讨其毒杀作用机质[7,8]。

研究表明蓖麻籽具有剧毒, 主要有毒成分为蓖麻碱和蓖麻毒素即是“蓖麻毒蛋白”[9]。其中, 蓖麻毒蛋白是毒性最强的植物毒蛋白之一, 具有很强的杀虫、杀菌作用, 进入动物体内会被动物体自身所分解, 不会在生物链中富集, 且不会产生耐药性[9,10]。蓖麻碱是一种毒性较低的生物碱, 能引起呕吐和各种毒性反应, 可导致肝脏和肾脏损伤、惊厥、低血压和死亡等[11]。高倩圆等[12]研究蓖麻提取物对南方根结线虫活动影响时, 发现蓖麻水提液(蓖麻毒蛋白和蓖麻碱)对线虫具有较强毒杀能力, 目前关于蓖麻提取液对福寿螺毒杀作用的研究尚未见报道。

本文以入侵物种福寿螺为研究对象, 探究不同浓度梯度(0、0.5、1.5、3.0、4.5和6.0 g/L)蓖麻籽提取液对其灭杀效果, 并通过测定分析福寿螺肝脏组织生理生化指标变化, 探究蓖麻籽提取液对其毒杀作用机制, 旨在为现有的福寿螺生物防治, 提供一种创新高效和生态安全的生物控制技术。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的福寿螺采集自上海海洋大学镜湖,为避免福寿螺对实验条件产生应激反应, 采集的福寿螺在玻璃缸(60 cm×40 cm×45 cm)中以湖水和去氯自来水(1∶1配比)驯养72h, 以小白菜(1 kg)作为食物来源。在驯养后, 从玻璃缸中选择行为表现最佳的福寿螺若干, 作为实验螺。

1.2 实验方法

在塑料饲养缸(17.2 cm×13.5 cm×12.5 cm)中开展实验, 每个实验组及对照组分别放置10只实验螺。实验所用蓖麻籽采购于亳州康美大药行。

蓖麻籽提取液制备本实验采用生物浸泡法[13], 蓖麻籽烘干, 粉碎机粉碎得蓖麻粉, 称取6.0 g蓖麻粉, 于1 L去氯水中, 人工搅拌混匀, 在室温下静置24h, 用两层纱布过滤3次, 得蓖麻籽粗提取液,4℃冰箱保存, 备用。

福寿螺浸杀试验实验每组塑料饲养缸设置同等水量为1 L, 蓖麻籽粉粗提取液分别稀释成0.5、1.5、3.0、4.5和6.0 g/L的浓度梯度, 以去氯水作空白对照组, 随机挑选前期驯养的10只福寿螺(2.12±0.18) g放入不同浓度梯度的塑料饲养缸中,塑料饲养缸上放置打孔盖, 防止螺沿内壁爬出, 每组处理设置3个平行, 实验在室温(25±2)℃条件下进行。采用腹水法和针刺法(不锈针)[14,15], 分别在24h、48h、72h、96h和120h鉴定实验组和对照组中福寿螺的死亡情况, 为避免水体污染, 及时清除排泄物和死螺。

1.3 生理指标测定

生理生化指标过氧化氢(CAT)、蛋白定量(TP)和丙二醛(MDA)测试盒购自南京建成生物工程研究所, 所用试剂均为分析纯, 用水为去氯自来水, 实验在室温(25±2)℃条件下进行。

采用浸螺方法进行毒力测定, 用Origin8.6软件建立毒力回归方程, 估算福寿螺在72h的LC25、LC50、LC75提取液浓度值, 实验条件和实验方法同上。随机选取8只福寿螺置于亚致死浓度1.58(LC25)、3.82(LC50)和6.05 g/L(LC75)下48h, 对照组在相同条件下保持在等量的去氯水中, 每组实验设置3个平行。

实验组和对照组中随机选取5只福寿螺, 用去氯水反复冲洗螺体数次, 后快速取出其肝脏组织,用4℃生理盐水(0.9%)冲洗3次, 滤纸干燥, 称取1.5 g,冰水浴条件下置于研钵中, 按质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入匀浆介质(0.9%生理盐水), 手动研磨制成10%匀浆液, 转速2500 r/min下离心15min, 取上清液置4℃冰箱, 用于肝胰腺组织生理指标的测定。

蛋白质含量(TP)蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定[16]。取前期制备的10%肝胰腺离心上清液, 用生理盐水稀释成浓度为1%的肝胰腺匀浆液,按照蛋白质定量测试盒说明书, 分别在空白管、标准管和测定管中加入相应样品及试剂, 混匀, 静置10min, 波长595 nm, 光径1 cm, 双蒸水调零, 测定各管吸光度值。结果按照公式(1)进行计算, 数值以g prot/L表示。

丙二醛(MDA)含量丙二醛含量用TBA法测定[17]。取前期制备的10%肝胰腺离心上清液, 按照丙二醛测试盒说明书分别在空白管、标准管和测定管中加入相应样品及试剂, 混匀, 离心管盖上盖, 用针在盖上扎一小孔, 95℃水浴40min, 取出后流水冷却, 然后3500 r/min离心10min, 取上清液,532 nm处, 1 cm光径, 蒸馏水调零, 测定各管吸光度值。结果按照公式(2)进行计算, 数值以nmol/mL表示。

过氧化氢酶(CAT)含量过氧化氢酶含量用可见光法测定[18]。取前期制备的10%肝胰腺离心上清液, 用生理盐水稀释成浓度为1%的肝胰腺匀浆液, 按照过氧化氢酶测试盒说明书, 分别在对照管和测定管中加入相应样品及试剂, 混匀, 波长405 nm, 光径0.5 cm, 双蒸水调零, 测定各管吸光度值。结果按照公式(3)进行计算, 数值以U/mg prot表示。

式中, 271*为斜率的倒数。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel进行实验数据预处理, 在SPSS 23.0软件中进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 比较不同浓度处理对福寿螺毒杀效果的差异性,P＜0.0.5表明具有显著差异, 并进行不同生理生化指标间相关性分析。

2 结果

2.1 福寿螺浸杀效果

如图1所示, 实验进行24h, 在5个浓度梯度下实验组与对照组福寿螺均无死亡现象; 在48h后, 蓖麻籽提取液浓度为6 g/L的处理组中福寿螺出现死亡现象, 死亡率为11%; 在72h后, 与对照组相比, 各实验组福寿螺死亡率明显增加, 除0.5和1.5 g/L蓖麻籽提取液浓度下死亡率相同外, 其他各组存在明显差异(P＜0.05); 在96h后, 各实验组福寿螺死亡率差异显著(P＜0.05), 且4.5和6 g/L蓖麻籽提取液浓度下的死亡率均达到最高为100%; 在120h后, 对照组福寿螺开始死亡, 死亡率为10%, 蓖麻籽提取液浓度为0.5、1.5、3.0和4.5 g/L的实验组, 福寿螺死亡率较96h明显增大, 死亡率最低达到80%。总体而言, 蓖麻籽提取液的灭螺活性, 在24h后表现为随着时间的延长, 福寿螺死亡率呈逐渐上升趋势, 死亡率与浓度呈正相关, 且在蓖麻籽提取液灭螺72h时, 呈现极显著相关性(P＜0.01)。

2.2 福寿螺肝胰腺组织中生理指标变化

蛋白定量(TP)如图2所示, 福寿螺在亚致死浓度1.58(LC25)、3.82(LC50)和6.05 g/L(LC75)条件下, 相比对照组, 可溶性蛋白分别降低了49.24%、53.78%和28.40%。在LC25和LC50处理条件下肝胰腺组织中可溶性蛋白含量随蓖麻籽提取液浓度变化而变化, 两者之间降低量在0.05水平上差异显著。LC75相比LC25和LC50条件处理下, 可溶性蛋白含量反而增加, 且差异显著(P＜0.05)。

图1 不同浓度提取液处理下福寿螺随时间的死亡情况Fig.1 Mortality of snails with different concentrations of extract over time

过氧化氢酶(CAT)如图3所示, 福寿螺肝脏内CAT活性总体表现为先上升后下降的趋势。在提取液浓度为LC25(1.58 g/L)时, 福寿螺肝脏CAT酶活性增加了61.2%, 与对照组相比差异显著(P＜0.05); 而在提取液浓度为LC50(3.82 g/L)时,CAT酶活性降低了1.66%, 与对照组无明显性差异(P＞0.05); 在LC75(6.05 g/L)时CAT酶活性降低幅度最大达到87.53%, 与对照组相比差异显著(P＜0.05)。

丙二醛(MDA)如图4所示, 与对照组相比较, 福寿螺在1.58 g/L浓度组处理下, 丙二醛含量低于对照组, 这表明机体内的抗氧化机制被激活, 机体内的酶活性开始发挥作用保护组织免受自由基攻击。在浓度组3.82和6.05 g/L处理下, 丙二醛含量高于对照组, 且浓度6.05 g/L处理下丙二醛含量显著高于对照组(P＜0.05)。

2.3 理化指标相关性分析

图2 不同提取液致死浓度处理下蛋白质含量变化Fig.2 Protein content of different lethal concentration of extract

图3 不同提取液致死浓度处理下CAT活性含量变化Fig.3 CAT activity content under different lethal concentration of extract

生命体基本的过程通过生理生化活动实现, 通过测定肝脏组织生理生化指标揭示福寿螺受到外界环境胁迫时机体内部应激反应, 为进一步探究生理生化指标间关系, 深入了解蓖麻籽提取液灭螺机理, 对肝脏生理生化指标进行了相关性分析。由表1可知, 蛋白质含量与CAT活性呈负相关关系, 但相关性并不显著(P＞0.05); 蛋白质含量与MDA含量呈正相关, 相关性也不明显(P＞0.05); CAT酶活性与MDA呈显著负相关关系(P＜0.05)。

图4 不同提取液致死浓度处理下MDA含量变化Fig.4 MDA content in different lethal concentration of extract

表1 生理生化指标相关性分析Tab.1 The correlation analysis of physiological and biochemical indexes

3 讨论

3.1 福寿螺浸杀效果

福寿螺由于其具有的厚螺壳, 对自身起到良好的屏障作用, 能够有效帮助福寿螺躲避敌害[19]。毒杀液不仅对福寿螺起到致死作用, 对其行为也会产生影响, 研究蓖麻籽提取液毒杀福寿螺效果, 当福寿螺遇到胁迫环境时, 表现出逃避、紧闭螺魇等行为, 躲避药物浸入体内, 延缓药剂到达靶标部位时间[20]。研究表现出, 在蓖麻籽提取液处理的前24h,其各组福寿螺均未出现死亡现象, 很大程度上是由于福寿螺自身的调节功能, 及生物学特性对不良环境的反应所致。这与Xiao等[3]研究加拿大一支黄花对福寿螺的灭螺活性中福寿螺在石油醚提取物处理下死亡率变化曲线相似。

3.2 福寿螺肝胰腺组织中生理指标变化

肝胰脏是消化和解毒器官, 在许多代谢过程和动物能量消耗中起主要作用, 这种组织是敏感的,容易受到杀虫剂和水中污染物的伤害, 因此, 器官经常被用来监测毒物。本研究对蓖麻籽提取液处理下福寿螺肝胰腺组织的蛋白质总量、CAT酶活性和MDA含量变化进行了测定。

蛋白质是有机体结构和功能的重要组成部分,由于碳水化合物在福寿螺体内的含量是有限的, 当福寿螺抵抗外界胁迫环境, 体内供给能量不足时,蛋白质可作为能量需求的替代能源, 肝脏将蛋白质转化为葡萄糖, 以确保体内恒定的葡萄糖供应[21]。对比对照组, 福寿螺体内蛋白质含量显著降低(P＜0.05), 这与Shen等[3]研究的加拿大一枝黄花提取物对福寿螺灭螺活性研究结果一致, 其研究表明随着石油醚提取物剂量的增加, 肝脏组织中可溶性蛋白逐渐降低, 另外, 结果的差异性存在于: 本研究结果发现在6.05 g/L(LC75)处理下, 虽然蛋白质含量相比对照组明显降低, 但随蓖麻籽提取液浓度增大蛋白质含量呈现先减后增的趋势, 相比LC25和LC50处理, 蛋白质含量反而增加, 这可能是由于蓖麻籽中主要有毒成分蓖麻毒蛋白进入螺体, 导致测试蛋白质含量增加所致。蓖麻毒蛋白是一种植物性的蛋白, 其结构由A(效应链)和B(效应链)两条肽链组成, B链可以与细胞膜表面的糖蛋白相结合, 帮助游离的链或整个蓖麻毒蛋白分子进入到细胞内部, 与核蛋白体60-S亚基发生作用, 抑制氨基酸t-RNA与核蛋白酶的结合作用, 使得核酸的延伸因子减少, 从而使得核糖核酸发生失活, 抑制蛋白质的合成, 导致靶细胞死亡, 在进入动物体内后被动物体自身机体分解[9], 因此, 蓖麻毒蛋白有可能是导致蛋白质含量增加及螺死亡的主要原因, 进一步地,将进行相关性的研究。

过氧化氢酶(CAT)是一种在动植物体内广泛存在的末端氧化酶, 它的功能是对体内过氧化氢进行催化, 防止膜质过氧化等, 其中最重要的功能是参与活性氧化代谢过程[22]。在活性氧化过程中,CAT酶可以使H2O2发生歧化生成水和氧分子。在环境胁迫情况下, 生物体内活性氧大量增加, 从而导致体内自由基增多, 使细胞膜产生过氧化过程,破坏细胞膜, CAT酶参与生物体内活性氧防御系统,在清除超氧自由基、H2O2、过氧化物以及阻止或减少羟基自由基形成等方面发挥重要作用。国内外大量研究表明, CAT酶活性受毒物剂量的影响,当浓度较低时, 毒物对代谢具有一定的促进作用[23]。在亚致死浓度组处理下, CAT酶的活性呈先上升后下降趋势, 这个结果和李燮阳等[22]研究的阿维菌素胁迫下黄河鲤鳃组织中CAT酶的活性变化趋势一致, CAT酶的活性含量变化情况在一定程度上反映了机体的损害程度。

MDA是脂质过氧化物的降解产物, 是反映有机体氧化损伤最具代表性的指标之一[24], 它能与DNA和蛋白质等分子发生反应, 丙二醛含量的增加表示肝脏组织存在氧化损伤或生理损伤[3]。由上可知, 随着提取液浓度的增加, 提取液中有毒成分破坏了机体内的抗氧化酶机制, 降低了体内酶的活性,使得机体内的超氧自由基无法被清除, 导致大量脂质过氧化物降解, 从而使得机体内的丙二醛含量增加[25]。这与王元春等[25]研究X射线对仔鼠大脑枕叶皮层结构及大脑的影响中随着照射剂量的增大丙二醛含量一样。

3.3 理化指标相关性分析

如上所述, 蛋白质作为一种替代供给能源, 维持机体正常生理代谢, CAT酶作为清除自由基作用的抗氧化剂, 当机体自由基的脂质过氧化增强时,会消耗大量的CAT酶, 使得CAT酶含量下降。机体内蛋白质含量降低时意味着机体受到外界胁迫压力大, 则作为酶防御系统的CAT酶活性会相应地降低, 原理上蛋白质含量应该与CAT酶活性呈正相关关系, 但实验结果相反呈负相关关系, 这与上述的分析相对应, 可能由于蓖麻籽提取液中蓖麻毒蛋白成分被福寿螺摄入, 导致机体内蛋白质含量会随着提取液浓度的增加而增加, 但受外界胁迫作用蛋白质总量会低于对照组。MDA作为脂质过氧化过程的代谢产物, 机体中自由基的多少与MDA呈正相关, 当福寿螺肝胰腺组织中CAT酶活性降低时, 丙二醛含量则增加, 二者呈负相关关系, 这与赵虹等[26]研究急性期脑梗死患者血浆丙二醛与过氧化氢酶活性检测临床对照实验结果一致, 脑梗死急性期治疗前的MDA值升高, CAT酶活性降低, 治疗后MDA值降低, CAT酶活性升高。本实验结果表明蛋白质和MDA呈正相关关系, 这与罗丽琼等[27]研究低纬高原地区UV-B辐射对报春花丙二醛、蛋白质含量的影响结果相反, 丙二醛植物抵抗UV-B辐射损伤能力越弱, 叶片丙二醛含量就越高, 可溶性蛋白质含量也就越低, 原因可能与蓖麻籽提取液中蓖麻毒蛋白成分有关, 与本研究中的蛋白质含量变化相对应。

4 结论

(1)蓖麻籽提取液毒杀福寿螺起效慢, 48h时最高浓度6 g/L处理组表现出11%的死亡率, 72h后福寿螺的死亡率表现出随时间延长、浓度升高而增大, 且每一浓度处理组下福寿螺死亡率随时间延长差异极显著(P＜0.01)。(2)福寿螺受外界环境胁迫时机体内的应答反应, 表现出肝脏组织中蛋白质含量下降, 低浓度提取液促进CAT酶活性, 高浓度抑制其活性, MDA含量随肝脏组织脂质过氧化物的降解而增加。当然, 进一步地将更加深入地研究蓖麻籽提取液对福寿螺的毒杀效果的主要作用成分。(3)生理生化指标相关性分析表明, MDA含量与CAT酶活性呈显著负相关(P＜0.05), 蛋白质含量与MDA呈现正相关但不显著(P＞0.05), 与CAT酶活活性表现为负相关但不显著(P＞0.05), 进一步揭示了福寿螺在外界环境胁迫时机体内部的应激反应。蓖麻籽材料来源广泛, 作为生物源毒杀液表现出环境友好性, 制备绿色生态的蓖麻籽提取液毒杀福寿螺, 效果可行。