姚 佳，朱 婷，刘 浩，张 研，丁 刚，辛美丽，聂 明

(1.复旦大学 生命科学学院 生物多样性与生态工程教育部重点实验室，上海 200438；2.山东省海洋生物研究院，山东青岛 266104)

人工鱼礁(Artificial Reefs, ARs)作为经过地点和材料筛选后在海洋中人为放置的堆积物[1-2]，主要以商业养殖和生境恢复为目的[3]，在近海生态系统养护和生物资源恢复上起着至关重要的作用[4-5].人工鱼礁可以通过改善栖息地质量而吸引鱼类聚集、觅食和繁殖，增加经济鱼类的生物量[6-8]；人工鱼礁对底泥的硬化可以增加底栖生物群落的丰度和多样性[9-10]，改变人工鱼礁的营养通量，形成新的复杂的食物网[11-12].但目前对人工鱼礁的研究多集中在渔业资源恢复，而对海洋生态系统重要的组成部分——微生物的研究却屈指可数.

微生物占据了海洋90%的活体生物量[13]，其不仅是海洋微型动物的食物来源和海洋保护动物健康的重要影响者，更是地球生物化学循环的驱动者[14].微生物定植在人工鱼礁的表面，形成菌胶团吸引其他微生物附着与繁殖，这些微生物包括细菌、真菌、病毒与藻类，构成了人工鱼礁生物膜的基础[15-16].在海洋生态系统中，生物膜至少有3个明确的作用：(1)是各种海洋无脊椎动物幼虫定殖、接触和变态的基底[17]；(2)是动植物繁殖体的主要附着位点[18]；(3)是初级生产的主要来源与食物网的基础[19].生物膜可影响人工鱼礁中动物群落多样性，其微生物结构的轻微变化，都可能引起生态系统以及海洋动物健康的强烈波动[20-21].因此，研究人工鱼礁生物膜微生物的组成与动态变化是海洋动物保护的关键.

生物膜微生物具有代时短的特点，因此对环境变化响应极为敏感[22-23].由于近海人工鱼礁区渔业活动频繁，油污污染风险较大，人工鱼礁生物膜上的微生物组的结构与功能易受油污污染干扰.海水中石油油污是大多数生物的一个应激因素，会增加自由基、过氧化氢和单线态氧等活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的产生[24]，造成蛋白质和脂类的氧化和破坏，进而损伤细胞[25].研究表明，暴露在原油和分散剂(乳化后的油滴等)中可对微生物的群落组成和多样性产生持续影响[26-28].

黄渤海作为中国4大渔场之一，是重要的渔业水域[29]，其作为我国北部沿海地区许多渔业物种的产卵和觅食地，为超过2亿人口提供了渔业资源和环境.截至2015年，黄渤海区域人工鱼礁海域面积达346.7km2，拥有136个人工鱼礁国家级示范区，居全国首位.庙岛群岛位于黄渤海交汇处，是我国重要的海洋牧场示范区之一.为了认识不同鱼礁材料间生物膜微生物组(包括病毒、古菌、细菌与真菌)的差异及其对油污污染的响应，本研究以中国山东庙岛海洋牧场示范区为研究区，通过宏基因组和多样性分析等技术手段，比较了附着在金属框架和水泥上生物膜微生物组的多样性与功能的差异，并探究了油污污染对微生物组的影响.

1 材料和方法

1.1 实验设计及样品采集

本研究于2018年9月，在庙岛海洋牧场示范区投放以金属框架为支撑、水泥为主体的小型人工鱼礁(以下简称小礁)，进行微生物生物膜富集，并以特殊浮漂为标记，便于后期打捞.小礁材质与示范区大型人工鱼礁一致，并一起投入到20m深的水底(38.16°N,120.87°E).于2020年8月28日将小礁打捞上来.采样前一天将轻微漏油的渔船停在小礁水体附近，模拟渔业活动给人工鱼礁带来的油污污染情景.考虑到微生物生物膜对油污的强敏感性，油污处理持续时间为24h.用无菌敷料镊在小礁金属架和水泥材质上分别均匀刮取生物膜，置于60mm×15mm无菌无酶小培养皿内，-20℃运至实验室，并在48h内完成DNA提取.本研究将各处理中的重复样本均匀混合，以期通过较低的实验复杂性得到较高质量的实验结果.本研究最终得到无油污污染金属材质的微生物生物膜(IR1)，无油污污染水泥材质的微生物生物膜(CE1)，油污污染金属材质的微生物生物膜(IR2)和油污污染水泥材质的微生物生物膜(CE2)4份样本.研究区域及实验设计见图1.

图1 研究区域及实验设计示意图

1.2 测序

将生物膜4℃解冻后，用DNeasy®PowerSoil®Pro Kit(QIAGEN, GERMANY)试剂盒提取生物膜DNA，DNA浓度使用Qubit®4.0 Fluorometer(ThermoFisher Scientific, USA)进行检测.所有提取成功的DNA样品保存在-20℃.

使用515F和806R[30]引物扩增样品16S rRNA基因的V3～V4可变区，使用Tedersoo等人推荐的混合引物[31]扩增样品的转录间隔区2基因(Internal Transcribed Spacer 2, ITS2).引物两端含有Illumina测序接头和barcode序列.使用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, USA)切胶纯化PCR产物，使用IlluminaHiseq 2500平台分别进行扩增子和宏基因组测序.

1.3 数据分析

对扩增子测序数据使用Trimmomatic V0.33进行质量控制，得到Clean reads.在QIIME平台，对Clean reads进行拼接和分库.使用UCHIME V4.2对比RDP_gold数据库，对数据进行嵌合体去除，97%相似度可操作分类单元(Operational Taxonomic Units, OTUs)划分和分类信息获取.计算微生物群落Beta多样性(非加权平均聚类(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean, UPGMA)、NMDS分析、样品聚类热图及样品PCA、PCoA，使用binary jaccard指数进行计算).

对宏基因组测序数据使用Trimmomatic软件进行质量控制，bowtie2进行同宿主基因组序列比对，去除宿主污染，得到Clean reads.使用MEGAHIT[32]软件对Clean reads进行拼接组装，过滤短于300bp的contig序列，并用QUAST[33]软件对组装结果进行评估.采用MetaGeneMark[34]软件预测编码基因，并对编码基因进行通用数据库和专用数据库的功能注释(包括KEGG[35]、eggNOG[36]、Pfam[37]、SwissProt[38]、NR、GO[39]等通用数据库注释和CARD[40]、CAZy[41]等特殊数据库注释)，统计样品物种组成和丰度信息.

2 结 果

2.1 不同材质间生物膜微生物组群落组成的差异及其对油污污染的响应

宏基因组结果表明，在4种样本中，细菌是主要的微生物组分，平均相对丰度占整个微生物组平均相对丰度的81.47%(图2a)，两种材质间生物膜微生物组群落组成无明显差异.油污污染提高了生物膜上细菌(0.2%)、病毒(194.0%)和古菌(96.9%)的相对丰度，但减少了生物膜上真菌(-11.8%)相对丰度，且油污污染下金属材质上病毒相对丰度上升幅度大于水泥材质.油污污染后，金属材质生物膜的病毒相对丰度高于水泥材质生物膜，古菌相对丰度低于水泥材质生物膜，而无油污污染下的微生物组成在两种材质间差异较小(图2(a)).非加权平均法(UPGMA)分析结果进一步表明，样品微生物组间的相似性主要受到油污污染的影响，且无油污污染处理的两种材质间微生物组的相似性高于油污污染，说明油污污染可以增加不同材质之间微生物组的差异(图2(b)).

图2 人工鱼礁生物膜微生物组群落结构

扩增子分析结果表明，两种材质间生物膜的细菌群落结构相近(图3(a)).无油污污染样本中的蓝细菌门(Cyanobacteria)占绝对优势，其次是变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，且金属材质蓝细菌相对丰度高于水泥材质，放线菌相对丰度低于水泥材质.油污污染后以Epsilonbacteraeota(无译名)和变形菌门为主，其次是放线菌门，且金属材质上的变形菌门和放线菌门的相对丰度远高于水泥材质，Epsilonbacteraeota相对丰度低于水泥材质.可以看出，油污污染导致了Epsilonbacteraeota相对丰度的增加，降低了蓝细菌和放线菌的相对丰度，且水泥材质生物膜微生物组在油污的影响下变化幅度更大.UPGMA分析显示(图3(b))，样品细菌群落间的聚类主要受到油污污染的影响.细菌群落在属水平上的分析表明(图3(c))，油污污染使生物膜中细硫卵菌(Sulfurovum)和嗜硫单胞菌(Sulfurimonas)的相对丰度明显增加，金属材质生物膜中的Thiomicrormium(无译名)明显增加.

图3 人工鱼礁生物膜细菌群落多样性

真菌群落的分析结果表明，子囊菌门(Ascomycota)在4种生物膜中都具有明显优势，其次为担子菌门(Basidiomycota)，且两种材质间生物膜真菌群落组成差异较小(图4(a)).油污污染降低了生物膜中子囊菌门的相对丰度，但增加了生物膜中壶菌门(Chytridiomycota)的相对丰度，这些变化在水泥材质上更为明显(图4(a)).UPGMA分析结果表明，无油污污染的金属材质和水泥材质生物膜有着相似的真菌群落组成，但油污污染后金属材质生物膜与其他类型生物膜真菌群落产生差异(图4(b)).真菌属水平上的分析表明，油污污染增加了生物膜中曲霉(Aspergillus)的相对丰度，降低了青霉(Penicillium)和链格孢霉(Alternaria)的相对丰度(图4(c)).

图4 人工鱼礁生物膜真菌群落多样性

2.2 不同材质间生物膜微生物组功能的差异及其对油污污染的响应

宏基因组功能分析结果表明，金属材质生物膜功能基因相对丰度高于水泥材质生物膜(图5，第78页).油污污染显著降低了两种材质生物膜功能基因的相对丰度(金属材质：-6.8%,P<0.05；水泥材质：-20.8%,P<0.001，图5).金属材质生物膜上绝大多数功能基因的相对丰度高于水泥材质(78.6%，图5).在油污污染影响下，大多数功能基因呈下降趋势(78.6%)，且水泥材质生物膜功能基因相对丰度的下降幅度均大于金属材质.此外，油污污染增加了金属材质生物膜的氨基酸(图5[E])和辅酶(图5[H])转运代谢基因以及两种材质上能量产生和转换(图5[C])基因的相对丰度.

图5 人工鱼礁生物膜微生物组功能分析

宏基因组抗生素抗性基因分析发现，水泥材质上大部分抗生素抗性基因相对丰度高于金属材质(80.0%，图6，第78页).油污污染增加了绝大多数抗性基因的相对丰度(85.0%)，水泥材质更为明显.油污污染仅降低了两种材质上微生物组头孢霉素(Cephalosporin)基因的相对丰度，以及水泥材质上氨基苷类抗生素(Aminoglycoside)基因的相对丰度.

图6 抗生素抗性基因相对丰度分析

碳水化合物酶基因分析表明，油污污染增加了糖基转移酶(GT)和碳水化合物脂酶(CE)基因的相对丰度，从而促进了糖苷类抗生素的合成(图7，第79页)，但各种碳水化合物酶基因的相对丰度在两种材质中并没有明显差别.

图7 碳水化合物酶分析

3 讨 论

本研究发现，虽然金属材质和水泥材质生物膜微生物组群落结构差异较小，但金属材质生物膜上变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度远高于水泥材质(图3(a))，这可能与金属材质里的铁富集了较多的ζ-变形菌(Zetaproteobacteria)有关.这类微生物群最初发现于海洋高铁栖息地，可以产生各种丝状的微米级生物氧化物铁，为细胞提供维持生长所需的Fe(Ⅱ)和O2的通量[42-43]，影响生物膜中磷的动态[44]，并可吸收微生物产生的酸性多糖生物高聚物或周围环境中的有机碳以形成稳定的有机结构[45].因此，生物铁氧化物可为生物膜上的其他微生物提供稳定的生境，形成独特的营养结构，增加铁、磷循环相关微生物的相对丰度，使金属材质生物膜相关元素循环速率高于水泥材质生物膜.

UPGMA聚类表明，油污污染可改变生物膜的物种组成.油污污染提高了金属材质生物膜变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度，这可能是由于石油中烷烃和硫化物的输入刺激了变形菌门中不动杆菌属(Acinetobacter)和硫降解相关细菌属(Thiomicrormium，Sulfurovum和Sulfurimonas)相对丰度的增加(图3(c)).这与之前Pugovkin等对巴伦支海油污污染区细菌群落的研究结果相一致[46].不动杆菌可以降解多种烷烃[47]，其中一些还可利用生物表面活性剂溶解和乳化烃类[48-49]，将它们转化为简单的化合物供其他微生物和藻类利用[50]，从而促进生物膜的初级生产力.

水泥材质和金属材质生物膜微生物群落对油污污染的响应强度有所差别(图2(b)).油污污染降低了水泥材质生物膜上变形菌门的相对丰度，这可能与水泥材质中Epsilonbacteraeota的大幅上升相关.大部分非致病性的Epsilonbacteraeota都为无机化能自养营养型初级生产者，可通过氧化单质硫和硫代硫酸盐提供能量[51-52]，进而发挥重要的生产功能[53].油污污染向人工鱼礁中输入的硫化物为Epsilonbacteraeota提供了大量化能合成所需的底物，促进了其相对丰度的快速上升，从而降低了变形杆菌在生物膜中的数量优势.此外，水泥材质疏松多孔的结构较金属材质更易吸附油污供Epsilonbacteraeota利用.因此，油污污染刺激下Epsilonbacteraeota在水泥材质上增长更为迅速，这可能增加水泥材质上的初级生产和氮硫循环通量，并通过营养过程使次级生产产生波动.

油污污染降低了人工鱼礁生物膜上功能基因的总体相对丰度，尤其使细胞合成相关的功能基因受到抑制，但增加了能量产生转换和氨基酸转运代谢等相关基因的相对丰度(图5).为了尽量减少油污污染带来的氧化应激和细胞损伤，微生物可产生一系列酶来激活保护和恢复机制[54]，调节自身的生理和代谢活动变化[55]，并改变脂肪酸的组成[56].油污污染使大部分抗生素抗性基因和部分碳水化合物酶基因的相对丰度大幅提升(图6，图7)，表明油污污染后微生物会将更多的功能用于抵抗外界的生物与非生物刺激带来的威胁.此外，油污污染增加了糖基转移酶(GT)和碳水化合物脂酶(CE)基因的相对丰度，此类基因可促进糖苷类抗生素的合成和微生物细胞壁的降解[53]，增强对需氧菌的抗性.因此，这些功能上的转变可以在一定程度上提高人工鱼礁生物膜微生物的抗逆性.

总之，金属材质和水泥材质间的生物膜微生物组在群落组成和功能上差异较小.油污污染增加了人工鱼礁两种材质生物膜细菌、古菌和病毒的相对丰度，降低了生物膜微生物组功能基因的丰度，且水泥材质生物膜微生物组对油污污染的响应更为敏感.由于频繁的人类(航运)活动会强烈影响海洋生物膜微生物组群落结构，因此油污污染可能通过营养级联效应对渔业资源和海洋动物的多样性产生影响.