周麟依，任双鹤，郭亚男，樊乃境，江连洲,2,3，贾富国，王中江,5,6,，刘 军

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.山东万得福实业集团有限公司，山东 德州 253000；3.临邑禹王植物蛋白有限公司，山东 德州 253000；4.东北农业大学工程学院，黑龙江 哈尔滨 150030；5.克东禹王大豆蛋白食品有限公司，黑龙江 齐齐哈尔 230200；6.黑龙江国如生物科技有限公司，黑龙江 哈尔滨 150030）

深海鱼油是从深海鱼类动物体中提炼出来的不饱和脂肪成分，其中富含的两种ω-3多不饱和脂肪酸——二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是人体重要的不饱和脂肪酸来源。研究发现，鱼油具有多种生物活性功能，如降血脂、清除自由基、疏通血管、补脑健脑、调节免疫系统、预防心血管疾病等，使其在功能性食品行业拥有较大的开发前景[1]。然而，鱼油脂肪酸的高度不饱和性导致鱼油极其容易在光和热的作用下发生氧化，丧失其原有的生物活性和营养价值，限制了鱼油在食品工业中的发展[2]。因此，利用壁材对鱼油进行包埋，提高鱼油制品的感官品质和稳定性，对鱼油制品在食品工业中的应用具有重要意义。目前，根据芯材和壁材的性质及微胶囊的粒径、释放特性以及靶向性的要求，可选择不同的微胶囊化方法，具体分为物理化学法、物理机械法、化学法3 类。而考虑到鱼油微胶囊的芯材理化特性、操作便捷性和食品安全性，工厂常采用物理机械法进行制备。因此，物理机械法对鱼油纳米乳液的影响直接决定着鱼油微胶囊的产品品质。

目前，鱼油纳米乳液的加工方法主要有高压均质、空化射流和超声破碎3 种。綦玉曼等[3]研究了高压均质压力对薄荷油纳米乳液理化性质的影响，结果发现高压均质压力为80 MPa时薄荷油纳米乳液理化性质最为稳定。江连洲等[4]研究了大豆蛋白-磷脂酰胆碱纳米乳液超声制备工艺，确定了大豆蛋白-磷脂酰胆碱纳米乳液均质工艺的最佳工艺参数为超声功率500 W、超声时间9 min。Akbas等[5]比较了高压均质和超声破碎两种均质工艺制备的辣椒油纳米乳液，结果发现高压均质相较于超声破碎有更高的包埋能力。李杨等[6]研究了不同蛋白种类及微射流处理压力对鱼油微胶囊品质的影响，结果发现在合适处理压力下制备的鱼油微胶囊的包埋率、氧化稳定性和热稳定性均较好。江连洲等[7]研究了空化射流处理工艺对鱼油微胶囊的理化性质影响，结果发现在合适的工艺条件下得到的鱼油微胶囊微观结构呈球形颗粒，结构致密、颗粒形态完整、粒径小、表面含油率较低、包埋效果好。刘晓丽等[8]探讨了超声工艺对鱼油微胶囊及其贮藏稳定性和生物利用度的影响，结果表明超声辅助可以显著提高产品的理化指标和降脂活性。郑景霞等[9]探究了高压均质工艺对鱼油纳米乳液及其贮藏稳定性的影响，结果表明经处理后鱼油氧化稳定性和储藏稳定性显著提高。因此，均质工艺对纳米乳液的理化性质及后续微胶囊加工具有极大的影响[10-11]。但目前研究大多停留于一种均质工艺对油脂纳米乳液或微胶囊理化性质的影响上。空化射流技术的原理是在空化腔内使溶剂分子受到空化作用、高速剪切及剧烈振动，促使产生空泡，这些空泡迅速胀大后瞬时闭合，产生剧烈冲击波，导致液体微粒间发生强烈的撞击作用，使大分子聚合物降解，致密结构被打开，从而有效发挥物料功能性质[12-13]。因此，该技术是一种集物料空化、均质、粉碎等操作于一体的新兴物理场技术。目前的研究大多停留在高压均质和超声破碎两种均质工艺对油脂纳米乳液理化性质的影响上[14]，对新型均质技术空化射流的研究较少，且鲜有将均质工艺作为影响微胶囊结构和理化性质因素的研究。

因此，本实验以易氧化、稳定性较差的深海鱼油作为芯材，根据前期实验结果选择大豆分离蛋白和磷脂酰胆碱作为壁材，经空化射流、高压均质和超声破碎3 种不同均质方式制备纳米乳液，通过喷雾干燥的干燥工艺制备微胶囊，从结构和理化性质两方面分析不同的均质工艺对鱼油纳米乳液及微胶囊的影响，从而为鱼油深度加工时均质工艺的选择提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（蛋白质量分数92.6%）、鱼油（含8.55% EPA、15.89% DHA）来源于深海沙丁鱼，购自山东禹王生态食业有限公司。

磷脂酰胆碱北京索莱宝科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠天津市东丽区天大化学试剂厂；常规分析纯级试剂北京化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

Ultra-Turrax T25高速分散器 德国IKA公司；JY92-IIN型超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S集热式磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；KL-80空化射流均质机北京中森汇嘉科技发展有限责任公司；JSM-6390LV扫描电子显微镜日本JEOL公司；JOYN-8000喷雾干燥机上海桥跃电子有限公司；BSA124S电子分析天平（0.000 1 g）北京赛多利斯仪器系统有限公司；TG16-WS台式高速离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司；HSS-1（B）型恒温浴槽成都仪器厂；Zetasizer Nano-ZS 90光散射粒度分析仪英国马尔文仪器有限公司；SGW-2傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪、PHS-3C雷磁pH计上海精密科学仪器有限公司；209F3热重分析仪 耐驰（上海）机械仪器有限公司；实验型高压均质机 英国Stansted Fluid Power公司；Turbiscan Lab分散稳定性分析仪 法国Formulaction公司；NDJ-8S型黏度计上海大平仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 粗乳液的制备

将4%（终质量分数，下同）大豆分离蛋白分散于0.1 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲溶液中，室温下连续搅拌120 min，作为水相；将0.8%鱼油和0.2%磷脂酰胆碱混合均匀，作为油相；在高速分散器的搅拌下把油相逐滴加入水相中，2 900×g均质5 min得到粗乳液。

1.3.2 鱼油纳米乳液和微胶囊的制备

将粗乳液分别通过高压均质机、空化射流均质机和超声波细胞破碎机进一步均质乳化即得不同均质工艺制备的鱼油纳米乳液。分别以均质压力、空化射流时间、超声功率为考察因素进行单因素试验，测定鱼油纳米乳液在不同均质条件下的平均粒径、Zeta-电位、黏度、稳定性。高压均质工艺采用的均质压力分别为60、100、140 MPa，均质4 次；空化射流工艺采用的空化射流时间分别为5、10、15 min，空化射流压力80 MPa；超声工艺采用的超声功率分别为250、400、550 W，超声时间9 min，超声温度20 ℃。将经过不同均质工艺处理的纳米乳液进行喷雾干燥，进风和出风温度分别为160 ℃和70 ℃，流速为600 mL/h的条件下制备鱼油微胶囊颗粒。

1.3.3 鱼油纳米乳液理化稳定性的测定

1.3.3.1 平均粒径、Zeta-电位测定

采用光散射粒度分析仪分别测定鱼油纳米乳液的平均粒径和Zeta-电位，鱼油油滴的折射率设置为1.45，水相溶液折射率设置为1.33。为了降低多重光散射效应，分析前用pH 7.5的磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L）稀释鱼油乳液100 倍后测定平均粒径，稀释50 倍后测定Zeta-电位[3]。

1.3.3.2 黏度测定

采用流变仪测定乳液的流变学特性，实验条件：平板直径60 mm、间距1 mm、扫描范围0.1～200 s-1。在20 ℃下测定剪切速率为65 s-1时的表观黏度。

1.3.3.3 稳定性测定

采用Turbiscan Lab稳定性分析仪测定乳液稳定性。量取20 mL鱼油纳米乳液于仪器自带的圆柱形玻璃杯中。玻璃杯外径27.5 mm、高度70 mm。设置仪器参数：扫描时间6 h、环境温度60 ℃、扫描间隔30 min，测定乳液稳定性指数（Turbiscan stability index，TSI）[3]。

1.3.3.4 乳化产率测定

采用紫外光谱法定量分析纳米乳液的乳化产率[3]。分别以无水乙醇为溶剂配制不同质量浓度的鱼油溶液，在最大吸收波长处测定吸光度，得到标准回归方程。称取一定质量的样品溶液并记录制备样品时添加鱼油的质量（m1/g），然后将样品溶液在40 ℃水浴加热15 min后，用超声波处理1 h，取上层清液，容量瓶定容至50 mL，测定吸光度，根据标准回归方程计算鱼油质量（m2/g），通过公式（1）计算乳化产率。

1.3.4 鱼油微胶囊理化指标的测定

1.3.4.1 包埋率测定

精确称量5 g鱼油微胶囊样品于锥形瓶中，加入40 mL 50 ℃石油醚后低速搅拌浸提2 min，抽滤取滤液，滤渣中加入40 mL石油醚洗涤2 min，再次抽滤取滤液，合并滤液并转移至恒质量的烧杯（m1/g）中，在65 ℃烘箱中烘干至恒质量（m2/g）。精确称量5 g鱼油微胶囊样品并充分研磨，采用索氏提取法测定微胶囊中油的总质量/（m3/g）。通过式（2）分别计算样品的包埋率[12]。

1.3.4.2 水分质量分数的测定

微胶囊水分质量分数的测定参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》，将0.5 g样品置于铝盘中105 ℃烘干12 h，根据公式（3）计算微胶囊水分质量分数。

式中：m0表示原始微胶囊质量/g；m1表示烘箱处理后样品质量/g。

1.3.4.3 溶解度测定

取5 g样品于烧杯中，加入50 mL蒸馏水，磁力搅拌至样品充分溶解，将溶液转移至离心管内，于4 500 r/min条件下离心10 min，取沉淀，加入50 mL蒸馏水搅拌溶解后再次离心，再次取沉淀并将其转移至已称质量的烧杯（m1/g）中，在105 ℃的烘箱内将其烘干至恒质量（m2/g），根据公式（4）计算微胶囊溶解度[13]。

式中：m表示样品质量/g；ω表示样品的水分质量分数/%。

1.3.4.4 微观结构观察

将少许微胶囊均匀分散在粘好电导胶的样品平台上，吹去多余粉末，样品平台置于离子溅射仪中喷金，电流强度10 mA、加速电压5 kV，用扫描电子显微镜观察微胶囊微观形态结构。

1.3.4.5 热重分析

称取6 mg鱼油微胶囊采用热重分析仪进行热重分析。在非等温条件下，温度从50 ℃升高至800 ℃，升温速率为10 ℃/min，氮气吹扫流量为80 mL/min。

1.3.4.6 过氧化值测定

将一定量的样品均匀地铺在锥形瓶底，放入（65±1）℃的隔水式恒温培养箱中进行油脂的加速氧化反应，每天测定一次过氧化值。过氧化值参照SC/T 3505—2006《鱼油微胶囊》[15]中微胶囊过氧化值测定方法测定。

1.3.4.7 FTIR光谱测定

称取1 mg微胶囊，加入100 mg溴化钾压片后进行FTIR测定。测定波数范围为400～4 000 cm-1的吸收光谱，设定分辨率4 cm-1、波数精度0.01 cm-1、扫描次数64、环境温度25 ℃[16]。

1.4 数据处理与分析

实验中所有数据以平均值±标准差表示，所有指标均重复测定3 次，利用SPSS Statistics 20.0软件单因素方差分析的Tukey’s HSD法进行差异性检验，P＜0.05为显著性差异。采用Origin 9.1软件、PeakFit 4.12软件进行数据分析、图表处理及图谱分析。

2 结果与分析

2.1 均质工艺对鱼油纳米乳液理化指标及稳定性的影响

由表1可知，在不同均质条件下，随着均质化强度的提高（空化射流时间延长、高压均质压力增大、超声功率增大），平均粒径呈现先降低后升高的趋势。均质过程中的剪切力具有细化液滴、减小粒径的作用，但过高强度剪切作用产生的紧密空化泡会屏蔽剪切力对液滴的影响，阻止液滴的分散，导致平均粒径增加。经过空化射流处理的乳液最小平均粒径为287.82 nm，较高压均质和超声破碎处理的最小平均粒径低18.69 nm和39.67 nm。随着均质化强度的提高，TSI先降低后升高，说明乳液稳定性先升高后降低，与此同时，黏度呈现先升高后降低的趋势。空化射流工艺制备的纳米乳液具有最低的平均粒径，这是因为空化射流在空化过程中会产生使乳液中空化泡溃灭的微射流，有效促进了液滴的扩散，降低了纳米乳液的平均粒径[17]。高压均质工艺制备的纳米乳液具有较低的平均粒径，这是因为高压均质过程可以通过高强度剪切力作用来实现对鱼油纳米乳液粒径的有效缩减。超声工艺也能通过超声空化效应实现鱼油纳米乳液的均质化，但是从平均粒径角度衡量，其均质化效果明显不如另外两种均质工艺。纳米乳液平均粒径和乳液稳定性间存在相关关系，平均粒径越小乳液稳定性越高，并且伴随纳米乳液平均粒径的降低，纳米乳液中液滴数量提高，促使纳米乳液黏度增大。因此对比分析结果表明，空化射流均质工艺较高压均质、超声工艺能显著降低鱼油纳米乳液的粒径和提高乳液稳定性。但3 种均质工艺均存在过处理效应。

与空化射流相比，高压均质和超声破碎处理强度对乳液Zeta-电位影响较小。随着空化射流处理时间的延长，纳米乳液Zeta-电位绝对值先增大后趋于平稳。静电排斥对带电液滴聚集的稳定性起重要作用，Zeta-电位的绝对值越小意味着油滴之间形成的静电排斥力更小，可能不足以克服液滴和能垒之间的分子间吸引力（即范德华力和疏水吸引力），从而引起乳液在自然条件下发生絮凝，液滴倾向于发生聚集，导致分层率增加[18]。而当Zeta-电位的绝对值大于30 mV时，依靠强静电排斥即可稳定乳液液滴[19]，数据表明3 种均质方式形成的纳米乳液都以这种方式保持稳定。对比3 种均质工艺发现，空化射流工艺的乳化产率最高，其次是高压均质，超声破碎乳化产率最低。均质工艺通过足够高的能量输入以减小纳米乳液中液滴体积。根据幂律分布，可以将乳液的平均液滴直径描述为能量密度（Ev）的函数，即每单位体积的能量输入。因此，液滴直径越小，乳化效率越高[20-21]。空化射流对乳化产率的影响可能归因于其对蛋白质结构的影响，在空化腔内蛋白受到空化物理场的作用导致大的蛋白亚基转变为小的亚基，进而形成水溶性聚集体，同时改变蛋白疏水性和结构柔性，降低表面界面张力和形成的乳液粒径，从而影响大豆蛋白的乳化性和纳米乳液的乳化产率[22]。

2.2 均质工艺对鱼油微胶囊包埋率、溶解度和水分质量分数的影响

表 2 均质工艺对鱼油微胶囊包埋率、溶解度和水分质量分数的影响Table 2 Effect of homogenization process on encapsulation efficiency,solubility and water content of fish oil microcapsules

由表2可知，随着均质化强度的增加，空化射流和高压均质工艺制成的微胶囊包埋率均呈现先升高后降低的趋势。经过空化射流处理制得的微胶囊最大包埋率为87.44%，较高压均质和超声破碎处理的最大包埋率高出7.08%和8.80%。均质工艺通过改变蛋白质的水合能力以改变大豆蛋白作为微胶囊壁材的包埋能力，均质过程能促进水-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用，改善大豆蛋白形成凝胶网络的能力，进而提高微胶囊壁材的包埋能力[22-23]。而空化射流均质工艺制备的鱼油微胶囊包埋率显著高于高压均质和超声破碎工艺的原因可能在于空化射流诱导蛋白质发生一、二级结构变化，形成可溶性聚集体，而在高压或热处理条件下聚集体会发生二硫键/巯基的转换，当巯基向二硫键方向转化时，蛋白质形成凝胶和界面活性的能力发生改变[24]。因此，空化射流均质工艺可能通过形成粒径更小的乳液液滴和更为稳定的乳液界面，进而提高喷雾干燥后鱼油微胶囊的包埋率。

由表2可知，通过3 种不同均质工艺制备的微胶囊水分质量分数差异不显著，制备的9 种微胶囊水分质量分数均介于4.7%～5.1%之间，水分质量分数较低，并和商品用微胶囊水分质量分数接近，达到SC/T 3505—2006规定的水分质量分数，不易发生霉变或结块。3 种均质工艺得到的微胶囊均具有较高的溶解度，其中空化射流和高压均质处理组具有更高的溶解度，超声处理得到的微胶囊溶解性稍差。综合鱼油纳米乳液和微胶囊的理化性质，优选空化射流10 min、高压100 MPa、超声400 W的均质工艺进行扫描电子显微镜观察和稳定性实验。

2.3 微胶囊的微观结构

图 1 均质工艺对鱼油微胶囊微观结构的影响Fig. 1 Effect of homogenization process on microstructure of fish oil microcapsules

如图1所示，空化射流工艺所制得的微胶囊颗粒表面光滑、连续、致密、无裂纹和空隙。说明空化射流制备的微胶囊大豆蛋白对鱼油进行了有效包埋，颗粒有部分向内的褶皱，但对微胶囊整体包埋效果影响不大。高压均质工艺所制得的微胶囊表面连续性尚可，向内褶皱程度较大，颗粒表面有大量微孔。超声破碎工艺制得的制得的微胶囊表面出现断层和较大的孔洞。3 种均质工艺所得到的微胶囊均有少量小颗粒与大颗粒相互黏连，可能是干燥和冷却过程中颗粒表面缩水导致；微胶囊颗粒表面多孔以及出现细纹的可能原因是壁材没有完整地包裹内部芯材[25-26]。与另外两种工艺相比，空化射流工艺所得到的鱼油微胶囊微观结构更为松散、圆滑和舒张，这可能是空化射流工艺处理后蛋白表现出较大的柔性，亲水性基团的暴露使得蛋白的亲水性增强；同时内部疏水基团向外伸展暴露，亲油性增强，两者达到良好的平衡[27]，纳米乳液中蛋白质能完整地包裹在鱼油油滴表面，使制得的微胶囊表面更加完整、光滑。这主要是因为空化射流均质工艺能更好地通过改变鱼油外部的壁材结构和纳米乳液性质，进而使微胶囊形成更加稳定和结构致密饱满的微观结构。这和空化射流均质工艺对鱼油纳米乳液微胶囊包埋率影响的结果相吻合。

2.4 均质工艺对鱼油微胶囊热稳定性的影响

从图2可以看出，鱼油微胶囊在500 ℃时基本完成分解。在150 ℃前，高压均质和空化射流工艺制得的微胶囊具有良好的热稳定性，质量损失速率随温度的升高而降低。可能原因在于温度的升高使得微胶囊水分蒸发，表面硬化，阻止内部快速分解，而超声破碎制得的微胶囊50～100 ℃时质量损失速率较高可能是由于颗粒包埋率较低，微胶囊表面的鱼油快速氧化分解，降低了微胶囊整体的耐热性。温度在200～500 ℃区间内的质量损失主要来自于壁材的降解和内部鱼油的蒸发，空化射流工艺组的鱼油微胶囊先达到最大质量损失速率，但实际损失总量始终低于高压均质工艺。这可能是因为空化射流均质工艺得到鱼油微胶囊具有更加稳定和结构致密饱满的微观结构，从而导致结构热稳定性提高。

图 2 不同均质工艺微胶囊差热分析曲线Fig. 2 Differential thermal analysis curves of fish oil microcapsules prepared by different homogenization processes

2.5 均质工艺对鱼油微胶囊氧化稳定性的影响

图 3 均质工艺对鱼油微胶囊氧化稳定性的影响Fig. 3 Effect of homogenization process on oxidative stability of fishoil microcapsules

由图3可知，被包埋鱼油的氧化稳定性要高于暴露在空气中的鱼油。微胶囊由于有壁材的保护，有效阻隔了油脂与氧气的直接接触，氧化速率相对减缓。微胶囊颗粒表面油脂最先开始氧化，实验过程中微胶囊颗粒过氧化值的下降可能是由于氧化油生成的过氧化物进一步氧化生成醛类和酮类物质[28-29]。随着贮藏时间的延长，蛋白包裹鱼油的微胶囊体系逐渐崩解，鱼油通过微胶囊上的细孔或从微胶囊内部外溢与空气直接接触，促使微胶囊的过氧化值上升。经空化射流处理制备的微胶囊过氧化值曲线最为平缓，氧化速率最慢。高压均质和超声破碎处理制得的微胶囊过氧化值曲线相似。这可能是因为空化射流工艺形成的微胶囊微观结构更为致密、平滑和无细微裂纹和具有更高的包埋率及较低的表面油含量，能更好地阻碍鱼油和空气接触而发生氧化反应，减缓了鱼油微胶囊的氧化速率[30-31]。

2.6 鱼油微胶囊的FTIR分析结果

图 4 鱼油微胶囊FTIR光谱Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of fish oil microcapsules

由图4可知，3 种鱼油微胶囊在FTIR图中1 065 cm-1和1 249 cm-1处的吸收峰分别对应磷脂酰胆碱PO2-的对称振动和非对称振动吸收谱带。在2 800～3 000 cm-1范围内形成相距80 cm-1的2 850 cm-1和2 930 cm-1的双峰，分别对应脂肪族—CH2和—CH3的伸缩振动峰。1 600～1 700 cm-1和1 540 cm-1处分别对应大豆蛋白酰胺I带和酰胺II带。然而，图谱在1 650～1 680 cm-1之间未出现含有分子内氢键的不饱和羧酸类单吸收峰，在1 745 cm-1处未出现代表不饱和双键的伸缩振动峰，在3 010～3 100 cm-1范围内仅出现较弱的代表不饱和双键的伸缩振动单峰。FTIR结果表明，3 种均质工艺制得的鱼油微胶囊壁材对芯材的包埋效果良好，未出现鱼油外泄从而使鱼油不饱和脂肪酸的FTIR吸收峰强度减弱现象。

3 结 论

空化射流工艺制备的纳米乳液相较于高压均质和超声破碎有着较小的粒径、较高的乳化产率和乳液稳定性。3 种均质方式制备的纳米乳液在Zeta-电位和黏度方面相差不大。

纳米乳液制备的微胶囊理化性质及稳定性与均质工艺有关，经过空化射流处理制备的微胶囊包埋率和溶解度相对较高，微胶囊颗粒呈球形，表面光滑，且热稳定性和氧化稳定性能较好。高压均质和超声破碎制得的微胶囊包埋率和溶解度较差，颗粒表面分别出现微孔和较大的孔洞，热稳定性和氧化稳定性较差。FTIR结果表明3 种微胶囊的包埋效果较好，未出现鱼油外泄。因此，对比分析发现空化射流均质工艺是一种生产品质较佳的鱼油纳米乳液及微胶囊的新型均质工艺。