汪洋，王玉娟，武九龙，徐天舒

(南京鼓楼医院中医科，江苏 南京 210008)

卒中后抑郁(Post-stroke depression，PSD)是卒中后常见并发症之一，主要表现为情绪低落、兴趣丧失、睡眠障碍等，严重者甚至会有自残、自杀的行为[1]。其发病可能与炎症细胞因子、神经内分泌、海马神经元再生障碍、卒中损伤部位等因素有关[2]。目前，针对脑卒中后抑郁的主要治疗方法有药物治疗、心理治疗和中医干预等。药物治疗由于价格昂贵、起效慢、治疗周期长等副作用，限制了其在临床中的应用[3]。中医学认为，脑卒中后抑郁为“中风”“郁症”合病。其病位在脑，与五脏六腑的功能失调有关[4]。气机不畅、气血亏虚是其主要病因；发病机制为正虚邪中、血瘀痰阻、蒙蔽清窍；故治疗应以行气活血、调理阴阳、宁心安神为治则。针刺法基于中医的经络学说，是中医治疗中风和郁证的常法。电针是在毫针针刺机体得气后，将电针仪连接毫针输出连续或断续的脉冲电流，以达到防治疾病的一种针刺方法，具有可重复性、疗效好、不良反应少等优势[5]。近年来有很多临床案例采用针刺疗法治疗PSD表现出良好治疗效果，但是其作用机制尚不明确。故本研究通过制作PSD大鼠模型，探索电针疗法对卒中后抑郁症状的改善作用，以及是否与血清炎症因子和神经营养因子的调节及神经功能保护有关。

1 材料

1.1 实验动物

健康成年SPF级雄性SD大鼠60只，体质量220～250 g，斯贝福(北京)生物科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010，饲养于室温22～26 ℃，昼夜节律，相对湿度40%～70%，适应性饲养1周。

1.2 实验试剂与仪器

大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫试剂盒(abcam，ab100767)，大鼠白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫试剂盒(abcam，ab234570)，大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫试剂盒(abcam，ab46070)，Anti-BDNF antibody(abcam，ab108319)，Anti-IGF1 antibody(abcam，ab36532)，Anti-NGF antibody(ab52918)，尼氏染色试剂盒(索莱宝，G1436)，苏木素伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝，G1120)，盐酸氟西汀(上海上药中西医有限公司，国药准字H19980114)，TTC染色液(索莱宝，G3005)。

生物倒置显微镜(OLYMPUS，IX73-A21PH)，全波长酶标仪(Thermo，Multiskan Sky)，低温离心机(Thermo，Fresco17/17R)，电针仪(苏州医疗用品厂有限公司)，切片机(徕卡，RM2235)，电泳及转模系统(Bio-Rad，1658033)，凝胶成像系统(上海天能科技有限公司，4600)。

2 方法

2.1 实验分组与模型建立

将适应性饲养1周后的大鼠随机按假手术组、卒中后抑郁组、电针组、氟西汀组分为4组，每组10只。除假手术组外，参照Longa等[6]行大鼠中动脉阻塞手术(MCAO)，将线栓由颈外动脉插入大脑前动脉，完成大脑中动脉血流阻塞；假手术组，不插入线栓其余操作相同。除假手术组，其余组手术结束后2 h再灌注，按照Longa评分法，选取评分1～3分入组，手术结束后恢复1周后进行慢性不可以预测温和刺激(CUMS)，每日选取1种刺激，持续28 d，建立大鼠PSD模型。MCAO模型结束24 h后用TTC染色计算梗死面积、HE染色验证脑卒中模型成功建立。

2.2 给药干预

从刺激之日开始，假手术组和卒中后抑郁组分别灌胃生理盐水2 mL；电针组予30 min电针治疗，取穴：取心俞、肝俞、神门、太冲、膻中、百会等穴，神门、太冲接电针仪，频率2 Hz，电流强度以大鼠耐受为宜。氟西汀组灌胃盐酸氟西汀5 mg/kg，每日1次，持续28 d。

2.3 TTC染色

MACO模型手术后，在假手术组和脑卒中组中随机挑选3只大鼠，取脑，取出的脑组织放入-20 ℃冷冻30 min后，每隔2 mm切1片，切成5片。将脑片置于TTC染色液中，37 ℃水浴锅中避光染色30 min，间或翻转脑片，使染色均匀。染色后10%甲醛固定10 min拍照，并计算梗死面积。

2.4 HE染色

MACO模型手术后，在假手术组和脑卒中组中随机挑选3只大鼠，取血后用生理盐水灌注直至肝脏发白，再用4%的多聚甲醛灌注，充分固定后断头取脑，并用4%多聚甲醛固定24 h后，经脱水、浸蜡和包埋，用石蜡切片机切成4 μm石蜡切片，烤片脱蜡后进行HE染色封片后，用显微镜观察组织形态。

2.5 行为学指标

2.5.1 糖水偏好实验 快感缺乏是抑郁模型动物的主要症状，糖水偏好实验用于检测动物的快感缺乏症状。正式测试前，给予质量浓度为1%的蔗糖水适应24 h。适应结束后，大鼠单笼饲养并禁水禁食12 h，然后每只大鼠分别给予提前称质量的1瓶质量浓度为1%的蔗糖水和1瓶自来水，12 h后蔗糖水和自来水互换位置。再过12 h后，收集剩余的蔗糖水和自来水，再次称质量，并计算糖水偏好率(Sucrose preference，SP)。

SP=蔗糖水摄入量/(蔗糖水摄入量+自来水摄入量)×100%。

2.5.2 强迫游泳实验 将治疗后的所有动物进行强迫游泳实验，将大鼠放入水深50 cm的圆柱形桶内，桶内水温25 ℃，持续观察6 min，并记录后4 min内不动时间，用摄像机拍摄记录大鼠游泳过程。

2.5.3 旷场实验 旷场实验是用来评价动物在新环境下自主行为、探究行为和紧张度的方法。建立100 cm×100 cm×40 cm的立方体旷场，底面用黑线分成等面积的50块小方格。以大鼠移动距离为活动评分，记录大鼠在5 min内活动距离。每次实验后清理动物排泄物并保持旷场内干燥整洁。

2.6 ELISA实验

每组随机取6只大鼠，在行为学检测结束后，用10%水合氯醛进行麻醉，通过腹主动脉取血，装入5 mL无抗凝剂负压管内，室温静置6 h后用3 000 r/min，离心20 min，取上清液待测。根据ELISA试剂盒说明书操作检测血清中炎症指标IL-1β、IL-6、TNF-α在样本中的含量。

2.7 Western blot实验

取血后的大鼠，取大脑海马部分，加入10倍体积的RIPA裂解液匀浆、离心取上清液为总蛋白。蛋白溶液加入一定体积的上样缓冲液并通过高温变性即得样品，备用。经过SDS-PAGE凝胶电泳分别孵育一抗BDNF(1∶1 000)、IGF-1(1∶1 000)、NGF(1∶1 000)4 ℃过夜，二抗孵育后加入ECL显影液放入凝胶成像仪中曝光并拍照保存。

2.8 免疫荧光

每组随机挑选3只大鼠，在行为学检测结束后，按照2.4的方法制作石蜡切片。石蜡切片经过脱蜡水化，用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液微波炉加热保持微沸状态10 min，双氧水室温孵育10 min，再用正常山羊血清室温封闭30 min，一抗BDNF按1∶100稀释，4 ℃过夜孵育。二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，并用DAPI进行核复染。染色结束后用生物荧光显微镜观察拍照，并统计阳性率。

2.9 尼氏染色

石蜡切片常规脱水至水，置于50～60 ℃尼氏染色液浸染30 min。95%乙醇迅速分化，之后经乙醇、二甲苯脱水、封片。用显微镜观察尼氏小体并拍照。

2.10 统计学方法

3 结果

3.1 MCAO模型建立

完成MCAO手术后，经神经机能学评价，与假手术组相比，经过MCAO手术的大鼠神经机能评分明显升高(P<0.01，图1d)，说明脑卒中模型制备成功。经过TTC染色，明显看出MCAO手术后的大鼠脑梗死面积明显增加(P<0.01，图1c)。再通过HE染色病理切片证明，与假手术组相比，经过MCAO手术的大鼠脑组织，大片神经细胞稀疏且排列不规则，数量明显减少。细胞质水肿疏松，细胞核致密深染(图1b)。以上实验证明MCAO手术成功，完成脑卒中模型建立。

注：与假手术组相比，**P<0.01。

3.2 电针组对卒中后抑郁大鼠抑郁行为的影响

从脑卒中模型大鼠中挑选出行为学评分1～3分入组，手术结束后恢复1周后进行CUMS造模4周，建立PSD模型同时进行电针和氟西汀治疗。最后一次给药1 h后进行行为学检测。糖水偏好实验结果，与假手术组相比，卒中后抑郁组的糖水饮用比例明显减少，而与卒中后抑郁组相比，经过电针和盐酸氟西汀治疗后糖水饮用比例升高(P<0.01，图2a)。在强迫游泳实验中，与假手术组相比，卒中后抑郁组大鼠不动时间明显增加，而与卒中后抑郁组相比，电针组和氟西汀组大鼠不动时间减小(P<0.01，图2b)。旷场数据表明，电针和氟西汀均不是通过引起大鼠中枢兴奋性产生抗抑郁作用，表明电针的安全性。

注：与卒中后抑郁组相比，**P<0.01。

3.3 电针对脑卒中抑郁大鼠炎症因子的影响

ELISA结果表明，与假手术组相比，卒中后抑郁组大鼠血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著增加，而电针组和氟西汀组显著降低了卒中后抑郁组大鼠血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量(P<0.01，图3)。

注：与卒中后抑郁组相比，**P<0.01。

3.4 电针对脑卒中抑郁大鼠神经营养因子的影响

Western blot结果表明，与假手术组相比，卒中后抑郁组大鼠海马中BDNF、IGF-1和NGF含量显著减小(P<0.01)，而电针组和氟西汀组与卒中后抑郁组相比，大鼠海马中的BDNF、IGF-1和NGF含量显著升高(P<0.01，图4)。

注：与卒中后抑郁组相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 电针治疗可增加PSD大鼠海马内BDNF表达

免疫荧光结果表明，卒中后抑郁组海马内BDNF表达量相对于假手术组明显减少，而电针组和氟西汀组明显增加脑卒中抑郁大鼠海马内BDNF的表达(P<0.01，图5)。

注：与卒中后抑郁组相比，**P<0.01。

3.6 电针对PSD大鼠神经元受损的影响

采用尼氏染色法观察神经元的损伤情况，尼氏小体是分布于各种神经细胞内的小块状物质，可被甲基紫、焦油紫等碱性染料染成紫蓝色。尼氏小体会因生理状态的变化而改变，当神经细胞受到刺激时，胞体内的尼氏小体会明显减少。经尼氏染色的脑片可以看出，卒中后抑郁组尼氏小体缺失较为明显(P<0.05)，表明神经细胞损失严重，而给予电针组和氟西汀组治疗可显著改善卒中后抑郁大鼠的神经元损伤，说明电针治疗可改善PSD大鼠的神经元损伤(P<0.01，图6)。

注：与卒中后抑郁组相比，**P<0.01。

4 讨论

脑卒中是一种急性脑血管疾病，起病急、愈后差，易伴随出现抑郁、焦虑等情感功能障碍。卒中后抑郁为脑卒中后常出现的情感功能障碍之一，据相关报道显示，25%～75%的脑卒中患者会出现脑卒中后抑郁障碍[7]。主要有情绪低落、食欲减退和睡眠障碍、自我效能感低下等表现。脑卒中后抑郁常规治疗方法是在治疗脑卒中药物的基础上给予抗抑郁药物，最常见的抗抑郁方法是口服盐酸氟西汀，但存在起效慢，伴随胃肠道反应、坐立不安等不良反应的弊端[8]。

中医认为，脑卒中后抑郁为“中风”“郁证”之合病，患者多表现为“神”的异常，脑是主宰神的器官，故治疗脑卒中后抑郁当从脑论治。传统医学的经络学说在治疗精神疾病方面具有悠久的历史，针刺即为经络学说实施治疗的主要手段之一[9]。原络调神针刺法是根据张道宗教授“病变在脑，首取督脉”的学术思想发展而来，通过针刺神门、太冲这2个原穴，调节阴阳平衡、通达脏腑气血;针刺心俞、肝俞这2个背俞穴，发挥养心安神、疏肝理气和益肾的功效;针刺膻中，宽胸理气、协调阴阳;针刺百会穴，提升阳气，开窍醒脑。故通过针刺心、肝的原穴及背俞穴再配合任脉、督脉穴位，共奏安神解郁、醒脑开窍的良好功效[10]。既往研究表明针刺刺激可对脑神经进行信息反馈，帮助脑组织修复，在脑卒中康复治疗中应用较多[11]。本实验研究表明，对PSD大鼠进行针刺治疗后，抑郁相关的行为学体征得到了很好的改善作用，血清内相关的炎症指标和神经营养因子指标也趋于向正常指标靠拢；脑内的BDNF水平和尼氏小体明显增加。进一步证实了临床疗效的确切性。

发生脑卒中后，为去除损伤坏死组织、维持机体功能，机体IL-6、IL-1β和TNF-α炎症指标应激性分泌增加，导致组织发生炎症水肿，引发神经功能损伤[12]。IGF-1是一种促生长细胞子，可通过血脑屏障，其水平升高可促进神经细胞的再生，进而改善神经功能；BDNF和NGF是作用于神经元的细胞因子，其高表达可营养神经，促进受损神经元的再生，改善脑卒中后抑郁病情[13]。BDNF广泛存在于海马、大脑皮层等部位，作用是增加突出可塑性，营养并支持多种神经元，提高神经元生存率，减少神经细胞凋亡，促进神经再生[14]。尼氏小体是合成更新细胞器所需的结构蛋白、合成神经递质所需的酶类以及肽类的神经调质，可作为神经元功能状态的标志。当神经元受到损伤时，尼氏小体可减少、解体甚至消失。本实验结果显示，经过治疗后，PSD模型大鼠的行为学指标明显好转；与模型组相比，电针组和氟西汀组炎症因子水平均降低，神经营养因子水平升高；脑内BDNF水平上升，尼氏小体也明显增加。究其原因可能是，中医针刺治疗具有“经脉所过，主治所及”的特点。针刺神门、太冲、百会等穴能增加脑内血流量，减轻脑卒中带来的脑组织损伤，同时调节脑组织内血管活性物质的含量，从而修复脑神经元，达到改善神经功能的目的[15]。针刺心俞、肝俞可调节下丘脑-垂体-肾上腺轴，从而抑制炎症因子的释放，减轻机体炎症反应；还能减少促肾上腺皮质激素的释放，有助于增加BDNF、IGF-1、NGF等神经营养因子的含量，从而改善抑郁症状[12]。针刺太冲，具有熄肝风、清头目、疏肝养血的功效。

综上所述，采用电针疗法治疗卒中后抑郁大鼠，可以很好地改善抑郁症状，减轻机体炎症反应，增加神经营养因子，修复神经元，减轻脑组织损伤，进一步阐明了针灸治疗脑卒中后抑郁的相关机制。