张丹丹，苑 璐，邵露营，朱佳琳，周延清*

(1.河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007； 2.河南省周口市科技局，河南 周口 466000)

0 引言

【研究意义】地黄(Rehmanniaglutinosa)是一种栽培历史悠久的大宗中草药，属于玄参科地黄属多年生草本植物，具有重要的药用、食用、观赏和经济价值。其根以鲜地黄、生地黄和熟地黄等形式用于临床实践，具有养阴生津、清热凉血和抗肿瘤等功效，是六味地黄丸和知柏地黄丸等中成药的重要原料。地黄富含梓醇、地黄苷、毛蕊花糖苷和糖类等诸多药效成分。其中，地黄糖类包括水苏糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、毛蕊花糖、果糖、半乳糖和甘露三糖等。因此，研究地黄糖酵解关键酶基因对于阐明其代谢途径和品种改良具有重要意义。【前人研究进展】植物糖酵解涉及的酶相当多，其中，烯醇化酶是广泛存在于动植物体糖酵解过程中的一个重要限速酶,催化磷酸甘油酸脱水形成磷酸烯醇式丙酮酸，在植物中具有催化糖酵解、抗逆、影响植物的生长和生殖发育和转录调控等多种功能[1]。目前，已经从拟南芥、茶树、盐芥、水稻和玉米等植物中克隆了烯醇化酶，研究了其功能[2]。但是，少见地黄烯醇化酶基因的报道。【研究切入点】在前期的地黄块根转录组测序挖掘毛蕊花糖苷生物合成途径相关酶及其相应基因、阐明其合成途径及分子机理的研究中挖掘的大量地黄基因[3]，包括7个糖酵解酶基因，烯醇化酶基因为其中之一。烯醇化酶不仅是糖酵解的关键限速酶，而且具有抗逆、参与植物的转录调控、生长发育等功能[1]。因此，对地黄烯醇化酶基因进行进一步研究。【拟解决的关键问题】以前期转录组测序挖掘的地黄品种温85-5的糖酵解关键酶-烯醇化酶基因碱基序列为材料[3]，利用计算机和生物信息学软件研究地黄烯醇化酶基因(RgENO)编码蛋白质的同源性、理化性质空间结构、跨膜结构区、亚细胞定位、信号肽分析及根、茎和叶中的表达情况，为进一步深入研究该基因的结构特征和糖酵解及抗逆功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

地黄品种温85-5成熟植株的根、茎和叶。地黄发育根转录组测序挖掘烯醇化酶(EC：4.2.1.11)基因Contig4172，780 bp[3]，命名为RgENO。内参基因RgTIP41引物序列和扩增产物详见文献[3]。RT-qPCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMII购自TAKARA公司(日本)。

1.2 方法

利用软件Primer Premier 5.0 设计qRT-PCR引物。引物方向5′→3′，正向引物：TGAGTGGGGTTGGTGTAAGC；反向引物：ATTGATGACATTGAAAGCGGG，引物为英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，预期扩增产物172 bp；NCBI的Blastp同源性检索，ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对RgENO理化性质分析，应用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和KinasePhos2.0(http://kinasephos2. mbc.nctu. edu. tw/index.html)预测RgENO蛋白质的跨膜区和对磷酸位点进行分析，SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)对地黄RgENO氨基酸序列进行信号肽分析，SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_ sopm.html)分析RgENO蛋白的二级结构，InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析RgENO蛋白的结构域；用改良后的Trizol法提取地黄品种温85-5植株的根、茎、叶的总RNA，用紫外微量分光光度计和1%的琼脂糖凝胶电泳分别检测所提RNA的浓度和完整度。qRT-PCR 在LightCycler 96实时定量PCR仪上进行，具体程序参见文献[3]。采用2-△△Ct方法计算RgENO的相对表达量[3]。用Microsoft Office Excel 2007作RgENO的空间表达图。

2 结果与分析

2.1 RgENO同源比对

根据RgENO的碱基序列，利用NCBI中的BLASTp软件搜索发现，RgENO基因与芝麻(基因注册号XP_011094426.1)、大豆(NP_001237329.2)、猴面花(XP_012840098.1)、可可(EOY08109.1)和长蒴黄麻(OMO68215.1)的烯醇化酶基因编码蛋白质的氨基酸序列同源性分别高达96%、91%、94%、94%与93%(图1)。

图1 RgENO的多重同源比对结果 Fig.1 Multiple homology alignment result of RgENO

2.2 RgENO编码酶的理化性质

在线软件预测RgENO基因编码蛋白质由260个氨基酸残基组成，包括26个酸性氨基酸(Asp+Glu)和27个碱性氨基酸(Arg+Lys)，相对分子量为27 654.69，等电点是7.69，分子式是C1233H1965N329O373S9，不稳定系数为24.73，脂溶指数为90.46，总平均亲水性(GRAVY)为-0.120，由此推测RgENO蛋白为稳定、亲水性蛋白；采用Kinase Phos 2.0对RgENO进行磷酸化结构预测，其具有12个丝氨酸的磷酸化位点(8、10、11、25、33、37、89、131、150、151、、223、248)，10个苏氨酸的磷酸化位点(12、41、53、56、69、179、203、211、228、231)和9个酪氨酸的磷酸化位点(15、27、105、163、174、210、226、232、256)。

2.3 RgENO蛋白质的跨膜结构

一般当X轴数值高于500时，可以认作是跨膜结构域。用TMHMM Server v.2.0预测地黄RgENO蛋白质的跨膜结构结果(图2)表明，RgENO编码酶无跨膜结构。

2.4 RgENO蛋白质的信号肽预测与保守结构域预测

将RgENO的氨基酸序列输入Signalp-5.0在线工具，进行信号肽预测结果发现，RgENO不具有跨膜运输功能，属于非分泌型蛋白。利用InterProScan和NCBI的Conserved domains search预测RgENO具有烯醇化酶所具有的N-端和C-端保守结构域。在氨基酸序列的116-260位C末端有TIM barrel domain，属于TIM磷酸结合超家族。

2.5 RgENO蛋白质的空间结构预测

采用SOPM预测ENO蛋白的二级结构表明,α螺旋40%，无规则卷曲31.54%，伸展链19.23%，β转角9.23%。因此认为，RgENO的二级结构主要为α螺旋、无规则卷曲和β转角组成。

2.6 RgENO蛋白质的亚细胞定位

使用WoLF PSORT蛋白亚细胞定位预测方法[4]对RgENO蛋白质进行亚细胞定位发现，在其K最临近值在细胞核、线粒体、细胞质、分泌系统囊泡、过氧物酶体和液泡中的值依次为34.8%、30.4%、21.7%、4.3%、4.3%和4.3%，RgENO蛋白质在细胞核中定位的K最临近值最大，可能定位与细胞核中。

2.7 RgENO的空间表达

以RgTIP41为内参基因，用qRT-PCR技术检测RgENO在地黄块根、茎和叶中的相对表达量结果(图3)表明，RgENO在茎中的表达量最高，其次是叶中，块根中最低。

图3 RgENO基因在成熟地黄植株块根、茎和叶中的表达量Fig.3 Expressions of RgENO gene in tuber, stem and leaves of matured R. glutinosa

3 讨论

研究用转录组测序地黄烯醇化酶基因RgENO，用生物信息学分析软件对其分析发现，其与其他植物种类的烯醇化酶基因同源性高达91%～96%，具有烯醇化酶所具有的N-端和C-端保守结构域(TIM barrel domain)，属于烯醇化酶。其他植物种烯醇化酶基因研究表明，其催化糖酵解过程，具有抗逆性等功能。如从耐低温马铃薯品种中克隆的糖酵解途径上的StEnolase基因，一定程度上能够调控马铃薯块茎低温糖化，影响转基因株系芳香族氨基酸的合成[5]；胁迫响应基因可通过依赖脱落酸信号途径和非依赖脱落酸信号途径进行调控[6]；茶树CsENO在脱落酸胁迫下能表达且受到不同程度的诱导，属于依赖脱落酸信号通路的植物逆境响应基因[7]；在植物抗冷胁迫中还存在一种非脱落酸依赖的信号通路-CBF/DREB调控网络。CBF/DREB基因编码转录因子，其表达产物与植物的冷响应基因COR的顺式元件结合，诱导抗冷基因表达来提高植物的抗冷性[8]。拟南芥CBF基因的下游调控因子los2经过验证是烯醇化酶基因，是一个双功能酶基因，其间接地正调控冷应答COR基因，提高拟南芥的抗冷性[9]。因此，地黄烯醇化酶基因RgENO的发掘与功能预测对地黄糖代谢与抗逆性分子机制研究提供参考。另一方面，qRT-PCR技术检测地黄不同器官组织中RgENO基因均表达，但是表达量差异不明显，说明其是组成型表达，对于地黄糖代谢与抗逆具有重要作用。

4 结论

RgENO基因与芝麻、大豆、猴面花、可可和长蒴黄麻(OMO68215.1)烯醇化酶基因编码蛋白质的氨基酸序列同源性较高，分别达96%、91%、94%、94%和93%；RgENO蛋白为稳定、亲水性蛋白；其具有12个丝氨酸的磷酸化位点、10个苏氨酸的磷酸化位点和9个酪氨酸的磷酸化位点。RgENO编码酶无跨膜结构及信号肽，二级结构主要为α螺旋、无规则卷曲和β转角组成，蛋白质可能定位于细胞核中；RgENO在地黄的块根、茎和叶中均有不同水平的表达，但在茎中的表达量最高，在块根中最低。研究结果可为今后深入研究地黄烯醇化酶基因(RgEND)的结构特征和糖酵解及抗逆功能提供参考。