蒋彩云，杨仝新，张梦雨，邵梦佳，吴宜蓉

(江苏经贸职业技术学院 a.健康学院；b.江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏 南京 211168)

1 概述

近年来，国内外越来越重视中药材的质量安全问题。我国是中药材种植大国，中药原材料的储存、运输和加工过程的规范性日益受到重视。在这些过程中，温度和湿度的改变很容易滋长中药中的真菌毒素，从而影响中药材的质量和疗效，甚至影响服药者的身体健康。真菌是一种真核生物，作为含毒性次级代谢产物，通常通过种子和孢子传播进行繁衍活动。真菌毒素在自然环境中大量存在，可依靠土壤、水等介质进行传播。昆虫也可携带毒素进行传播和污染。在生存条件适合的情况下，真菌将进行大量繁殖。中药材易受真菌毒素污染，中药材中常见的真菌毒素是黄曲霉毒素(AF)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏马毒素、F-2毒素[1]。因此，加强中药材中的真菌毒素检测是十分必要的。本文对中药材中真菌毒素的常规及快速检测方法进行了综述，以期为有效监管中药质量安全、减少真菌毒素侵染提供参考。

2 中药真菌毒素检测方法

2.1 常规检测方法

2.1.1 薄层色谱法

薄层色谱法(TLC)是一种简单、方便、应用较为广泛的定性分析方法。利用待检测物质对吸附剂的吸附能力与样品中所含的其他物质不同的特点，当检测所用的展开剂流过固定相时，不同成分产生连续性的吸附-解吸附过程，最终分离，停留在不同位置。此分析方法操作简单，设备价格低，只需对样品进行简单的处理，适用于目标物质的快速检出。目前，中药真菌毒素检测使用较多的是常规薄层色谱法，在中药真菌毒素定性分析、半定量分析及辅助定量分析中发挥着极其重要的作用[2]。

卢志雁等[3]采用TLC法对7种中药材中的AF污染情况进行测定和分析。先采用氯仿提取法对粉碎之后的神曲、麦芽、杭菊等进行提取，再使用去油提取法对余下的四种样品进行去油脂提取，静置之前加入无水Na2SO4，1 h后定容至1 mL，使用TLC法进行检测。结果显示，神曲、越鞠保和丸含有较高的AF。该方法展开时间较长，长达200 min，前期样品处理、回流提取平均耗时13个小时，时间效率过低，灵敏度较低。检测结果可能会因为中药材中存在的各种物质，以及标准品和实际样品中所含的毒素不同而产生偏差。因此，该方法的应用具有局限性，多用于定性分析及辅助定量分析，可配合超高效液相-质谱联用技术(UPLC-MS)进行中药材中真菌毒素的检测及定量定性分析。

2.1.2 气相色谱法

气相色谱法(GC)是目前广泛使用的色谱分析技术，具有灵敏度高、分离效果好、稳定性高等优势。邱延涛等[4]使用气相色谱配合具有高灵敏度的电子捕获检测器，对一批从市场上采购来的中药材进行脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的测定。首先使用重蒸水对粉碎后的样品进行溶解，然后用均质器对溶解后的样品进行提取，取第二次滤液于锥形瓶内，优化柱子条件，选用免疫亲和柱进行慢速净化操作处理，衍生之后检测，DON的最低检出限为2 pg，相关系数为0.9999，回收率为85.5%～97.2%，并以气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)进行结果验证。常规GC法检测过程较长，且需专业人员进行操作，否则结果容易出现偏差，甚至对仪器造成损坏，因此应用时具有一定局限性。

2.1.3 液相色谱法

2.1.3.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)是目前用于物质定性定量的常用方法之一，具有检测速度快、效率高、选择性和重复性好、操作自动化、回收率较高等特点，加快了目标待检物的检测速度，减少了中药材成分多、基质复杂的干扰，能够满足中药材中多种真菌毒素的检测要求。

刘丽娜等[5]使用HPLC法测定虫草发酵粉中AF残留量，使用液相色谱配合荧光检测器对虫草发酵原料药进行检测。该方法效率高、准确性好、操作简便，适用于中药材中原料药的真菌毒素的定性定量分析研究。使用70%有机溶剂甲醇对样品粉末进行简单溶解提取，先用0.45 μm微孔滤膜进行过滤操作，再经免疫亲和柱进行净化，以甲醇作为洗脱液，将洗脱液浓缩至0.7 mL，用纯水定容至1 mL。利用此法进行检测，相关系数大于0.9998，回收率为80%～93%。使用LC-MS/MS进行结果验证，该方法结果准确，可作为原料药的AF筛查方法，科学有效地控制原料药的质量。刘宁等[6]使用此法测定参苓白术散中AFG2、AFG1、AFB2、AFB1，并使用MS法验证检测结果，结果证实此法简便、快速、准确，可用于上述中药材中多种AF的同时检测。

2.1.3.2 超高效液相色谱法

超高效液相色谱(UPLC)的色谱柱填料粒径比HPLC小3 μm左右，使得色谱柱的内结构在单位长度内增加了理论塔板数，分离程度得到很大提高；UPLC采用超高灵敏度的检测器和超高压输液泵，使得UPLC的检测灵敏度更高，分析结果更准确，UPLC的色谱峰容量也大大提高。采用UPLC法，药品检测分析人员能够在更短的时间内，以更高的色谱分离度对复杂物质进行分离[7]。目前，越来越多的药学研究者使用UPLC技术检测药品中的复杂成分。

曹纪亮[8]使用UPLC法对生姜中痕量OTA进行检测。采用乙腈-水溶液对样品中的待测物质进行提取，使用分子印迹固相萃取柱进行纯化操作，最后采用UPLC配合选择性较好的FLD对目标物质进行检测，并使用MS法进行结果确证，依据检测结果可得该方法回收率高于80%。此法简便快捷，可以科学检测生姜中的OTA。

邢言言等[9]使用UPLC法测定了陈皮中的4种AF，先使用甲醇PBS缓冲液提取，再使用免疫磁珠富集净化，最后使用UPLC-FLD法进行检测，分析检测结果得出四种AF的色谱峰面积与其对应的质量浓度呈良好的线性关系，平均回收率大于63.9%，相关系数良好。该方法具有样品预处理简单、检测速度快、检测结果准确等优点[10]，为陈皮中AF的检测建立了一种灵敏度高、准确性高、无需衍生化的方法。

2.1.4 液相-质谱联用技术

2.1.4.1 液相-质谱联用技术

液相-质谱联用技术(HPLC-MS)将HPLC和MS的优势相结合。该技术不仅具备HPLC的高分离优势，还充分利用质谱仪的高选择性、高灵敏性，大幅度提高了中药中真菌毒素含量测定的准确性，已成为真菌毒素污染检测的核心方法。

郑润生[11]建立一种使用HPLC-MS法测定中药中6种真菌毒素的检测方法，用于检测AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA及杂色曲霉毒素的污染情况。将中药材苦杏仁和太子参作为样品，采用84%乙腈作为提取剂，使用甲醇稀释4倍，并优化色谱流动相和洗脱梯度、重新设定质谱参数后进样检测，结果表明相关系数良好(R>0.995)，不需净化操作就能准确测定真菌毒素的污染情况。该方法具有准确度高、灵敏性高等优点。

2.1.4.2 超高效液相-质谱联用技术

UPLC与MS联用技术可以保留MS的优势。同时，UPLC独特的高灵敏度使得中药中真菌毒素的检测过程更高效、结果更准确。

李宁侠等[12]使用UPLC-MS法同时分析中药酒剂中F-2毒素、伏马菌素等多种真菌毒素的污染水平，回收率大于79.9%，相关系数R=0.9992。该方法操作步骤简单，所得结果准确性好、检测仪器灵敏性高、分离速率快，为中药材中真菌毒素限量标准的制定提供了科学有效的参考。

陈重均[13]将黄芪作为研究对象，对其所含有的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、T-2毒素等13种毒素进行检测。将10 mL乙腈加入黄芪粉末中，经30 min超声波震荡混匀；离心机设置12000 r/min的速度对样品进行离心，保留上清液；使用氮吹仪在固定温度、固定氮吹速率下进行氮吹，吹至约剩1 mL样品，再加入500 μL乙腈和25 mL纯水进行溶解、稀释，经HLB柱进行净化、洗脱操作后，在相同条件下重复氮吹；用浓度为15%的乙腈溶液将样品定容至1 mL，超声波震荡混匀之后使用孔径为0.22 μm的有机微孔滤膜进行进样前最后一步过滤操作；使用UPLC-MS/MS法进行检测，分析色谱图可得，所测的真菌毒素色谱峰面积与其对应的质量浓度呈良好的线性关系，该方法回收率高于84.1%。UPLC-MS技术离子化效率高、分离度高、重现性高、适用于分离中药材这种基质复杂的物质，因此常被用作中药中真菌毒素的检测及确证法。

2.2 快速检测方法

从中药原材料的生长、采收到中药材加工再到投入临床使用的每一个过程都有可能会遭到真菌毒素的侵染，而且中药品种繁杂，生长产地、加工产地、出厂批次的不同都可能使得同一种中药材含有的次生代谢产物不同，差异多达数十甚至数百种。想要对市场上的中药点抽取大批量样品进行快速、可靠筛查，必须建立科学且切实可行的真菌毒素快速检测方法。本文对市场上使用较为广泛的四种方法进行介绍。

2.2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(ELISA)是专门针对大批量样品中AFB1含量的快速检测法，具备检测速度快、检测方法简便、市场化等特点。

李汶等[14]用ELISA试剂盒检测六神曲、淡豆豉等中药材和中成药中的AFB1，使用70%甲醇PBS缓冲液提取制备样品，制作每毫升含标准毒素0.02～0.04 ng的标准品，将以上样品及标准品放入已提前处理好的试剂盒中，进行抗原抗体结合反应，最后使用酶联免疫检测仪进行检测，与空白对照孔及阴性对照孔做比较。结果表明，所测样品均受AFB1不同程度的污染。实验结果证明该方法灵敏度良好。李延生等[15]同样使用该方法测量一批中药材及中成药受AFB1的污染程度，检测限达0.01 ng，所测样品受AFB1污染程度也较高。该方法操作简便，检测所得数据准确率高。

2.2.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法(GICA)是一种结合胶体金显色特性和层析技术的固相膜免疫分析方法[16]。该方法以胶体金的物理性状(如颜色反应)为显色工具，将免疫学中抗原抗体细胞特异性结合这一特点与常规层析法相结合，从而完成对目标物的检测实验。

谢艳君[17]利用柠檬酸三钠的还原性质制备胶体金溶液，制成胶体金快速检测试纸条，对试纸条的特异性及灵敏性进行考察后，向天麻、茯苓、白及、白芷4种中药材空白基质10 g精密加入1、5、10 μg/kg AFB1溶液，滴在试纸条上，等待10 min后，观察结果。试纸有效的前提是C线显色，若T线显红色，表明所测样品为阴性，反之为阳性样品。结果测得回收率为85.78%～96.65%。该实验所制试纸条对样品提取液中AFB1的检测限最高为5 μg/kg，最低为1.25 μg/kg，符合AFB1限量标准的要求。该方法只需30 min就能完成检测，实验效率极高。李细芬等[18]在不含有AFB1的决明子、酸枣仁等6种中药材粉末中加入定量AF对照液，同标准曲线进行对照，应用胶体金方法检测酸枣仁、莲子、薏苡仁等6种中药材中的AFB1，检测结果与HPLC法一致。

该方法操作简单，不需要对操作人员进行特殊培训，稳定性好，灵敏性高，10～15 min就能获得检测结果，重复性好，生产和检测成本较低，无需任何仪器设备，适用于基层大批样品中目标物的快速检测，发展前景非常可观，在未来可能会发展为筛查中药真菌毒素污染的最好方法。但因中药材成分十分复杂，检测过程中，基质对检测结果影响较大，所以此方法在中药真菌毒素检测方面没有得到广泛应用，文献记载较少。选用此方法进行检测时应注意，待检测的物质尽量避免含有与标准品结构类似的物质，如以AFB1作为标准品时，应避免样品中含有香豆素类理化结构，以免检测结果出现偏差。

2.2.3 流式微球技术

在过去的十年中，流式微球技术在食品、农产品、环境等领域得到了越来越多的应用。该技术具有所需样品容量小、灵敏度高、特异性和重现性好、分析时间短、检测费用低及可以做到多种物质同时检测等优势，因此适用于现场目标物的快速筛查工作。流式微球技术(CBA)是应用流式细胞仪，使用具有独特荧光强度的编码微球，基于小分子物质抗原与免疫抗体之间存在的间接竞争免疫分析的原理，使得目标物直接或间接共轭于荧光微球的检测抗体，以完成复杂基质中目标物的定性及定量实验。

肖昌彬等[19]以磁光微球为载体，利用CBA技术对中药麦芽中OTA含量进行检测。首先使用60%甲醇PBS溶液进行提取，再加入浓度为20%的甲醇PBS溶液进行稀释操作，离心后与牛血清白蛋白-OTA(BSA-OTA)复合物在微球上进行偶联，将荧光素标记加入样品，使用离心机对其进行离心操作后，保留下部分样品，使用缓冲液洗涤之后，将制成的样品放入流式细胞仪通道对OTA进行准确检测，此方法检出限为0.12 ng/mL，平均回收率大于93.9%，相关系数良好，使用LC-MS/MS进行确证，得出此检测方法灵敏性好，准确度高，且其小麦样品提取操作简单，提取效率高，为中药麦芽中真菌毒素的检测提供了一种快速、经济的检测手段。

2.2.4 近红外荧光传感法

20世纪50年代，近红外技术首先被应用于农副产品的分析中，但在当时，该技术尚不完善，功能不健全，所以并没有被广泛应用在定性分析工作中；直到约30年之后，随着互联网技术的不断进步，近红外技术也得到了大幅度的提升，并且成为最有效的有机物质定量定性分析技术之一。

曾云龙等[20]采用近红外荧光传感法测定一批中草药中痕量OTA的含量。以近红外荧光碳量子点为检测探针，该方法的特异性结合体为OTA核酸适体，建立近红外荧光法配合核酸适体OTA形成的传感检测平台。平台建立期间，作者对传感体系组成、酸碱度、孵化时间等影响因素进行了一系列的研究分析，最终得出结论：OTA浓度在 0.015～1.5 ng·mL-1范围内检测效果较好，检测限为 8 pg·mL-1。在所测中药批次中，发现连翘、莲子、陈皮、甘草等均受到OTA的污染。该技术操作简单，碳量子源丰富，成本较低，被广泛应用于各检测分析领域。

3 总结与展望

本文将我国近年来针对中药材中真菌毒素的检测方法进行了概括总结，在此过程中发现，我国对于中药材中真菌毒素的检测方法种类较多，但各有优缺点。今后可将多种检测方法进行联用，优势互补，从而使得检测效率达到最大化。同时应积极研究发展针对伏马菌素、T-2毒素和F-2毒素的高效检测方法。

我国对于食品、饲料中的真菌毒素限量都有明确的标准，但中药材基质复杂、结构繁多，因此中药材真菌毒素残留检测方面的标准还不够完善。可参考我国食品、饲料等方面的真菌毒素检测方法，使用有效的方法对中药材中的真菌毒素进行检测研究试验，也可参考引用国外相关的实验数据，结合中国人的身体特点等综合因素考虑毒素限量，从而制订标准。