刘元林，田晓静,2，黄汇惠，柏家林,2，丁功涛,2，孙 娜,2，马忠仁,2，马占龙

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物医学研究中心中国-马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030；3.临夏市俊林清真肉制品有限责任公司,甘肃 临夏 731100)

我国是世界上牦牛数量最多的国家，主要分布在西北地区，以散户养殖方式为主[1-2]，2019年，全国屠宰牦牛约360万头[3].牦牛血液是屠宰过程中产生的最多副产品之一，也是一种优质的动物血资源，但其有较重的血腥味、消化性和适口性差、色泽感官不佳且原料血液极难保存等因素，严重制约着牦牛血资源的综合利用，造成资源浪费和环境污染[4]等问题.畜禽血液的开发已经运用到食品、医药、农业等多个领域[5-6]，如将猪血血球蛋白酶解液与氧化猪脂等原料进行热反应制备猪肉香精[7]；乌鸡血脱色后仍保留一定的抗血栓功能作用[8]；鸭血制备高亚铁鳌合能力的酶解产物[9]；驼血制备抗氧化和降糖活性肽[10]；鸡血发酵液体肥料可提高小白菜种子发芽率，降低硝酸盐，增加Vc含量[11]等.

目前，对牦牛血资源利用已有一定研究，如将牦牛血制作益生菌发酵牦牛血肠[12]；用酶解法将牦牛血红蛋白水解成易于吸收的小肽或氨基酸来生产高附加值产品，如牦牛血红蛋白粉[13]、氯化血红素[14]及补血营养品等[15]，从而提高生产产品的高附加值.获得高质量水解液成为生产的关键点.蛋白水解方法主要有酸水解、碱水解、酶水解以及微生物发酵等[16].酸、碱水解在一定程度上降低氨基酸质量[17]；酶水解反应条件温和；微生物发酵对菌要求较高，发酵细菌的培养过程十分漫长和复杂.酶处理血液资源成为目前研究的热点.利用水解获得丰富的氨基酸、肽类资源，可提高牦牛血资源利用率.

本文采用单因素试验研究风味蛋白酶的水解pH、温度、料液比、酶浓度、时间对牦牛血液蛋白水解率的影响规律，并采用五因素三水平正交试验优化水解工艺，以期为综合利用牦牛血液资源提供技术支持，也为开发牦牛血氨基酸产品提供基础研究.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛血采于甘肃省临夏市俊林清真肉制品有限责任公司，经粗滤后运至实验室.

L-8900全自动氨基酸分析仪(日本Hitachi公司)；LGJ-100F真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；FOSS scrubber 2501福斯蛋白质消化仪(福斯中国有限公司)；S2-Field Kit便携式pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；L3S可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司).

风味蛋白酶(山东隆科特酶制剂有限公司(10万U/g))；L-酪氨酸、福林试剂(北京索莱宝科技有限公司)；乙酸、硫酸、无水乙酸钠、硫酸铜、氢氧化钠、盐酸、邻苯二甲酸氢钾、硫酸钾、对硝基苯酚、三氯乙酸均为分析纯(烟台市双双化工有限公司)；甲醛(36%～38%)为分析纯(天津市百世化工有限公司).

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

采集的新鲜牦牛血液放入真空冷冻干燥机，在-45 ℃预冻2 h后，于0.01 Pa真空度下采用-40 ℃～25 ℃线性降温、升温的方法，将血液冻干成血粉(血粉得率为22.41±0.01%).过80目筛，除去毛、碎肉等杂物，自封袋封存于冰箱-4 ℃保存.

1.2.2 单因素试验设计

蛋白水解效果会受料液比、酶浓度、水解pH、水解时间、水解温度等因素的影响.本研究以蛋白水解率为指标，通过单因素试验研究风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白的料液比(1︰3.0、1︰4.5、1︰6.0、1︰7.5、1︰9.0 g·mL-1)、酶浓度(0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%)、水解时间(2、3、4、5、6 h)、水解pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、水解温度(40、45、50、55、60 ℃)对牦牛血液蛋白水解效果的影响规律.实验过程中每隔30 min以1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液调节pH至设定值.

1.2.3 正交试验设计

在单因素实验基础上，采用L18(37)进行5因素3水平的正交试验优化风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白的工艺，正交实验因素水平设计见表1.

表1 正交试验因素水平表

1.2.4 酶活力测定

参照GB/T 23527-2009蛋白酶制剂[18]中的福林法检测酶活，于680 nm波长下测风味蛋白酶试样的吸光值，以酪氨酸浓度为x轴，吸光值为y轴绘制标准曲线，回归曲线为y=0.0104x-0.0072，R2=0.9987，线性结果良好.

1.2.5 蛋白质含量的测定

参照GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的凯氏定氮法[19]，测牦牛血粉总蛋白含量平行样3次，以平均值计算.

1.2.6 蛋白水解率的测定

采用甲醛滴定法检测氨基酸含量，蛋白水解率[20]计算公式如下：

DH=(N-N0)/(Nt-N0)×100

式中：DH为蛋白水解率，%；N0为未水解样品中游离氨基酸的含量，%；N为水解液中氨基酸的含量，%；Nt为底物蛋白中的总氮的含量，%.

1.2.7 氨基酸含量的测定

样品处理：样品液中加入5%的5-磺基水杨酸，1 200 rpm/min离心15 min，去除蛋白后取上清液，使用全自动氨基酸分析仪检测水解产物中的游离氨基酸.

色谱条件：色谱柱4.6×60 mm磺酸型阳离子树脂，分离柱柱温50 ℃，反应柱柱温135 ℃，进样体积为10 μL.

1.3 数据处理

采用单因素方差分析(one-way-analysis of variance，one-way-ANOVA)进行显著性分析，由SPSS V17完成.试验结果图由Origin 8.0软件(美国OriginLab公司)绘制.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影响

结果如图1(A)所示，当料液比在(1︰3.0～1︰7.5) g·mL-1时，蛋白水解率不断上升；料液比为1︰7.5 g·mL-1时，蛋白水解率最大.之后蛋白水解率随料液比减少而降低.料液比在一定范围内能影响风味蛋白酶对牦牛血液蛋白的水解率，浓度过高过低都会使水解效率降低，选取较佳料液比为1︰7.5 g·mL-1.

A:料液比；B:酶浓度；C:水解pH；D:水解时间；E:水解温度

2.1.2 酶浓度对风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影响

结果如图1(B)所示，随酶浓度逐渐增加，蛋白水解率也在增大.酶浓度在0.25%～0.75%时，蛋白水解率增加趋势较快；酶浓度在0.75%～1.25%时，蛋白水解率增加趋势变平缓.经方差分析发现，1.00%酶浓度与1.25%酶浓度的蛋白水解率差异不显著(P≥0.05).综合考虑蛋白水解率与成本，选取较佳酶浓度为1.00%.

2.1.3 pH对风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影响

结果如图1(C)所示，在pH为6.0～6.5范围内蛋白水解率明显上升；pH为6.5时牦牛血液蛋白水解率达到最大；之后蛋白水解率不断下降，选取较佳pH为6.5.

2.1.4 水解时间对风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影响

结果如图1(D)所示，随水解时间的延长，蛋白水解率持续增加，其中2～4 h增加趋势较快，水解5 h与6 h的蛋白水解率差异不显著(P≥0.05).综合考虑蛋白水解率与时间成本，选取较佳水解时间为5 h.

2.1.5 水解温度对风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白效果的影响

结果如图1(E)所示，温度过低会降低酶活性，过高会使酶失活.随温度的升高蛋白水解率呈现先上升后降低的趋势，在50 ℃时牦牛血液蛋白水解率最高，选择较佳水解温度为50 ℃.

2.2 正交试验结果与分析

在单因素试验基础上，以水解pH、水解温度、料液比、酶浓度、水解时间为因素，以蛋白水解率为指标，采用五因素三水平正交实验优化，其设计见表2.

表2 正交试验极差分析

在单因素试验基础上，以水解pH、水解温度、料液比、酶浓度、水解时间为因素，以蛋白水解率为指标，采用五因素三水平正交实验优化，结果由极差分析(表2)和方差分析(表3)可知，五个因素对牦牛血液蛋白水解的影响都存在显著性.极差分析影响顺序依次为水解pH(A)>酶浓度(D)>水解时间(E)>料液比(C)>水解温度(B)；方差分析为水解pH(A)>酶浓度(D)>水解时间(E)>水解温度(B)>料液比(C)，即水解pH的影响最大，为主要因素；其次是酶浓度与水解时间，水解温度与料液比的影响较小.较佳水解工艺参数为A1B2C3D3E3，即水解pH为6.0、水解温度50 ℃、料液比1︰9.0 g·mL-1、酶浓度1.25%、水解时间6 h，此时蛋白水解率为33.42±0.44%.

赫玉兰等人[15]以牛血红蛋白为原料比较不同酶的水解效果，发现酶种类对水解效果有显著影响(P<0.05).韩学燕等人[21]利用中性蛋白酶水解牦牛血红蛋白水解，在pH为7.0、温度45 ℃、酶底物浓度比6 000 U/g、底物浓度5%、水解时间5 h条件下，蛋白水解率为31.32%.付彩霞[22]探究风味蛋白酶水解鹿血时较佳温度为50 ℃，最适起始pH为6.5.本实验优化结果与其相近，而文献[22]中先用4 500 U/g碱性蛋白酶在底物浓度8%、起始pH值8.0、反应温度55 ℃条件下水解鹿血1 h，接着加入1 500 U/g风味蛋白酶水解3 h，所得的鹿血酶解产物的水解度为27.95%.与上述研究相比，本实验酶添加量高、酶解时间长，水解率也稍高.为获得更加丰富的小分子肽及游离氨基酸，江霞等人[23]在风味蛋白酶与胰酶比例(0.96︰1)，水解温度50.88 ℃，初始pH为8.15，底物浓度6%，水解时间6 h的条件下酶解猪血蛋白水解率为43.13%.在相近的酶解时间与酶解温度下，复酶水解率高于单酶.为提高水解率，后续实验可考虑酶的复配工艺.

表3 正交试验方差分析

2.3 牦牛血液蛋白水解液氨基酸结果

表4 风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白氨基酸结果

为进一步探究优化的风味蛋白酶水解工艺对牦牛血液蛋白的水解效果，采用全自动氨基酸分析仪检测水解液中氨基酸的种类与含量，结果见表4.

氨基酸种类与含量在一定程度上直接决定了水解液的质量，牦牛原血与牦牛血液蛋白水解液氨基酸结果见表4.从表4可以看出，优化后的风味蛋白酶水解工艺在一定程度上提高了氨基酸质量，其中亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸的含量提高较多；鸟氨酸、脯氨酸、氨基丁酸的含量提高较少；水解液中新增添了天冬氨酸与谷氨酸.牦牛原血氨基酸总量为25.52 mg/100 mL.经风味蛋白酶水解后氨基酸总量为4 454.20 mg/100 mL.蛋白水解液的氨基酸总量是牦牛原血的氨基酸总量的174倍.由此可见，本实验优化后的水解工艺参数较理想.牦牛血酸水解氨基酸总量为20 051.75 mg/100 mL，氨基酸总量是风味蛋白酶水解液的4.5倍.但高温强酸的条件在一定程度上会破坏部分氨基酸，酸水解液中未检测到氨基丁酸、鸟氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸.酶水解条件较温和，水解液中氨基酸种类较齐全.后期对水解液的处理工艺较简单，一定程度上反映出酶水解的优势.

3 结论

为提高牦牛血液蛋白水解率，采用单因素实验和五因素三水平正交实验优化风味蛋白酶水解牦牛血液蛋白工艺.单因素实验发现，随料液比不断减小，蛋白水解率先上升后下降.随酶浓度逐渐增加，蛋白水解率也增大，之后增加趋势变平缓.当水解pH不断变大，蛋白水解率呈先上升后下降的规律.水解时间越长，蛋白水解率持续增大；水解温度不断升高，蛋白水解率呈现先上升后降低的规律.通过正交实验确定较佳的水解条件为A1B2C3D3E3，水解pH为6.0、水解温度50 ℃、料液比1︰9.0 g·mL-1、酶浓度1.25%、水解时间6 h.此时蛋白水解率为33.42±0.44%，且水解液氨基酸总量是牦牛原血氨基酸总量的174倍.该方法为合理利用畜禽血液资源进行生物产品大规模生产提供技术支持.