刘 洋 刘丽萍 陈绍占

(1.首都医科大学 公共卫生学院，北京 100069； 2.北京市疾病预防控制中心，食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室，北京100013； 3.北京市预防医学研究中心 100013)

前言

野生食用菌由于味道鲜美，富含氨基酸，营养丰富[1-2]，成为人们餐桌上的“常客”。然而，有研究表明[3-4]，由于食用菌富集重金属的能力很强，因而食用菌中重金属含量超标现象也屡见不鲜。砷是人们熟知的重金属之一，长期过量摄入会导致皮肤癌、肺癌等疾病，由于砷的形态很多，不同砷形态毒性不同，以砷化合物的半数致死量来计，其毒性大小依次为As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA>DMA>砷甜菜碱(AsB)，As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和统称为无机砷，无机砷毒性大，是致癌物质，而砷甜菜碱(AsB)等有机砷[5]几乎无毒，因此目前砷仍是研究的热点。《食品安全国家标准 食品中污染物的限量》(GB 2762—2017)中规定食用菌总砷的限量为0.5 mg/kg。随着研究的不断深入[6]，发现野生食用菌中存在不同的砷形态，为了更好地评估食用菌的安全性，新修订的《食品安全国家标准 食品中污染物的限量》(GB 2762-20XX)的征求意见稿中，将食用菌的总砷限量修改为无机砷限量，增加了银耳、木耳等食用菌中无机砷限量规定。

砷形态的分析检测方法主要有高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)法[7-8]、液相色谱-原子荧光光谱(LC-AFS)法[9]、离子色谱-电感耦合等离子体质谱(IC-ICP-MS)法[10]、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱(CE-ICP-MS)法等。其中，高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法因其灵敏度高、分离效果好等优点被广泛应用，但因其仪器价格和运行成本较高也限制了它的使用，液相色谱-原子荧光光谱法因价格成本较低、实用性强也得到广泛使用。

本实验选用新型的配有氢气发生器的液相色谱-原子荧光光谱仪分析研究食用菌中砷形态，氢气发生器的使用极大地节约了化学试剂的用量，所提供的稳定的氩氢火焰使得原子化效率更高，提高了检测灵敏度，操作方便。当不开紫外消解灯时砷甜菜碱等有机砷不能准确测定，本文主要对食用菌中亚砷酸根As(Ⅲ)、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷酸根As(Ⅴ)四种砷形态进行分析研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

配有自动进样器的Prin-Cen液相色谱仪(广州普临晟科技有限公司)；原子荧光光谱仪(北京宝德仪器有限公司)；Hamiton PRPX-100色谱柱及其保护柱；Milli-Q Integral超纯水处理系统(美国 Millipore公司)；新芝超声波清洗器；高速离心机(美国Beckman公司)。

磷酸氢二铵[(NH4)2HPO4]、硼氢化钾(KHB4)、氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)、氨水(NH3·H2O)、过氧化氢(H2O2)等均为分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)；65%硝酸(德国Merck)；亚砷酸根As(Ⅲ)(GBW 08666)、一甲基砷酸(MMA，GBW 08668)、二甲基砷酸(DMA，GBW 08669)、砷酸根As(Ⅴ)(GBW 08667)、砷甜菜碱(AsB，GBW 08670)等砷形态标准溶液均购于中国计量科学研究院。

1.2 样品前处理

1.2.1 砷形态测定前处理

称取食用菌试样0.5 g(准确至0.000 1 g)于50 mL 聚丙烯离心管中，加入20 mL硝酸(0.15 mol/L)，于60 ℃超声水浴中提取1 h，取出冷却至室温，于8 000 r/min离心10 min，吸取上层清液，经0.45 μm有机滤膜过滤后上机测定。按同一操作方法做空白实验。

1.2.2 总砷测定前处理

采用 GB 5009.11-2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》中电感耦合等离子体质谱法，称取0.3 g(准确至0.000 1 g)样品于微波消解罐中，加入6 mL浓硝酸和1 mL过氧化氢放置1 h，按相关操作步骤进行消解，冷却后，定容至25 mL，上机测定。

1.3 仪器工作参数

各仪器最佳工作参数见表1。

表1 LC-AFS仪器参数

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

阴离子交换色谱柱是目前用于砷形态分析最为广泛的色谱柱，常用的阴离子交换色谱柱有Hamilton PRPX-100、Dionex Ion Pac AS19等。其中，Hamilton PRPX-100[11-12]适用的pH值范围较广，在pH值为1～13范围内均适用，分离效果好，普适性强，价格适宜，出峰时间稳定，样品的前处理选用0.15 mol/L的硝酸提取时，其溶液呈酸性，此色谱柱较适宜，AS19色谱柱在酸性条件下，柱效会受到一定的影响，影响使用寿命，且价格较昂贵。因而本实验选用Hamilton PRPX-100色谱柱。

2.2 流动相的优化

由于食用菌中存在AsB等有机砷，需采用梯度洗脱进行砷形态的有效分离，液相色谱-原子荧光光谱法常用的分离体系A：1 mmol/L (NH4)2HPO4(pH=9)，B：20 mmol/L (NH4)2HPO4,对其进行优化，由于通常情况中As(Ⅴ)的灵敏度较低，对流动相B进行优化，分别配制(20、25、30 mmol/L)的 (NH4)2HPO4，通过测定1 mg/L AsB和10 μg/L的As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(Ⅴ)的混合标准溶液，不同浓度的流动相所对应的响应值如图1所示，随着流动相浓度的增加，As(Ⅴ)的信号响应值逐渐增加且出峰时间逐渐缩短，当采用30 mmol/L时，信号响应值和出峰时间均较好，因此，选择流动相B选择30 mmol/L(NH4)2HPO4为宜。

2.3 样品提取条件的优化

本次实验选用总砷含量较高的姬松茸进行优化，分别考察了硝酸(0.15 mol/L) 60 ℃超声1 h、100 ℃微波辅助提取和90 ℃热浸提1 h三种不同的提取方法对砷形态的提取效果，如图2可知，采用硝酸(0.15 mol/L) 60 ℃超声1 h方式提取砷效果较好，且方法简单便于操作，测定结果表明此样品不含有DMA 。

图1 不同浓度流动相B的砷形态分离色谱图Figure 1 The separation chromatogram of arsenic species in different concentration mobile phase B.

图2 不同提取方法对于砷形态的影响Figure 2 Effects of different extraction methods on arsenic species.

2.4 氢气发生器氢气输出流量的考察

实验表明，通过氢气发生器的使用，使得原子荧光光谱法所用还原剂和载流的使用量大大减少，当开机测定砷形态6 h以上时较传统LC-AFS仪器的还原剂和载流的使用量约减少2倍，实验中发现在不同的氢气输出流量下，四种砷形态的灵敏度不同，为了探究氢气的最佳输出流量，配制浓度为10.0 μg/L的As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(V)的混合标准溶液，在最佳仪器状态下考察，发现随着氢气输出流量的增加(见图3)，信号强度增加，当增加到110 mL/min时，信号强度达到了一个较优值，当流量大于110 mL/min后，信号强度缓慢下降，且当氢气输出流量过大时，会影响砷形态的测定。因此最终选用氢气输出流量为110 mL/min。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围及检出限

通过线性范围实验，结果表明本方法线性范围较宽，在0～100.0 μg/L的浓度范围内，线性相关系数均达0.999以上，图4为浓度10 μg/L 时4种砷形态化合物色谱图。将As(Ⅲ)、MMA、DMA、As(Ⅴ) 四种砷的混合标准储备液逐级稀释测定方法检出限，以3倍基线噪声时砷形态的浓度为检出限(S/N=3)，结果见表2，该仪器的检出限较传统LC-AFS[13]有明显的优势。

图3 不同氢气输出流量对砷形态信号强度的影响Figure 3 Effects of different hydrogen output flow rates on arsenic species signal intensity.

表2 线性范围及检出限

图4 4种砷形态色谱图(10 μg/L)Figure 4 Chromatogram of four arsenic species(10 μg/L).

2.5.2 方法的准确度和重现性实验

以加标回收实验考察方法准确度，以精密度来考察方法的重现性。

2.5.2.1 模拟样品精密度及加标回收实验

选用干姬松茸、鲜杏鲍菇、银耳不同类别的食用菌，添加三个不同浓度水平的混合标准溶液进行回收率实验，加标回收率在80.2%～106%。平行制备6个模拟样品进行精密度实验，计算相对标准偏差(RSD)，实验结果表明RSD值均小于5%，结果见表3、4、5，实验结果证明方法的重现性和准确度满足实验要求。

2.5.2.2 实际样品的精密度

选取砷含量较高的有机元蘑和牛肝菌进行方法精密度的测定，制备6个平行样品，测定其砷形态含量，分别计算相对标准偏差(RSD)，结果如表6所示，RSD值均小于5%。

2.6 实际样品分析

采集市售食用菌样品，根据GB 5009.11—2014方法一测定总砷，选择按GB 2762—2017判定总砷含量超出0.5 mg/kg的限量标准的杨树蘑、黄蘑、红蘑、草蘑、牛肝菌、姬松茸等样品，采用所建方法进行砷形态测定，分析结果见表7，其中编号10的野生食用菌总砷含量高达26.6 mg/kg，测定其砷形态如图5所示，在未开紫外消解灯的情况下，其有机砷AsB含量仍然较高，无机砷含量相对较低，而编号为11的有机元蘑中无机砷含量高达1.76 mg/kg，实验表明总砷含量高的食用菌(图6)，并不意味具有食品安全问题，快速准确测定食用菌中无机砷非常重要。

表3 姬松茸加标回收率和精密度

表4 银耳加标回收率和精密度

表5 鲜杏鲍菇加标回收率和精密度

表6 实际样品精密度测定结果

表7 食用菌四种砷形态含量

图5 编号10的野生食用菌砷形态色谱图 Figure 5 Chromatogram of arsenic speciations in wild edible No.10.

图6 编号11的有机元蘑砷形态色谱图Figure 6 Chromatogram of arsenic speciations of organic mushroom No.11.

3 结论

建立了液相色谱-原子荧光光谱法测定食用菌中砷形态的方法，在未开紫外消解灯的情况下可以准确测定食用菌中四种砷形态，使用氢气发生器可以大大减少还原剂和载流的用量，提高无机砷测定的灵敏度。通过实际样品测定表明，总砷含量高，并不意味无机砷含量高，不能代表其具有食品安全问题，因此对食用菌中有害的无机砷测定非常必要，以保证食品安全。实验结果表明，本方法操作方便，灵敏度高，准确、可靠，适用于食用菌中DMA、MMA和无机砷的测定，可为食用菌的安全评估提供技术支持，为《食品安全国家标准 食品总砷及无机砷的测定》(GB 5009.11—2014)方法的修订提供保证。