中性粒细胞胞外诱捕网的形成及其在生殖相关疾病中的作用

2021-03-28乔国栋王永红

国际生殖健康/计划生育杂志 2021年3期

乔国栋，王永红

中性粒细胞一旦发现异物或内源性威胁，就会采取一系列措施，包括吞噬和产生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）等，确保消除危害。中性粒细胞还可以产生趋化因子和细胞因子来警告附近的其他细胞，从而使宿主的免疫反应最大化。除此之外，中性粒细胞另一种防御方式是形成中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）来捕获病原体，中性粒细胞首先通过排出核和线粒体DNA来固定细菌，然后通过释放组蛋白和细胞质蛋白酶杀死细菌，并等待巨噬细胞吞噬。NETs除了在免疫防御中的功能外，在炎症、自身免疫和其他病理生理状况中也起着重要的作用[1]，如子痫前期（preeclampsia，PE）发病主要与胎盘滋养细胞侵袭异常和血管内皮细胞功能障碍等有关，通过调控NETs的表达,可导致血管内皮细胞凋亡增加，被认为是子痫前期患者血管内皮损伤的关键环节。

1 NETs概述

2004年Brinkmann等[2]首次提出了NETs的概念，描述了中性粒细胞在激活后释放了颗粒蛋白和染色质，一起构成了NETs。NETs的主要成分是核DNA和组蛋白，其次是颗粒酶和肽。其蛋白包括中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和肽聚糖结合蛋白等[3]。Yousefi等[4]研究表明，由活细胞形成的NETs包含线粒体DNA，但没有核DNA。通过阻止ROS产生的方法表明，NETs的形成依赖于ROS，这种现象同样存在于嗜酸性粒细胞中。Stojkov等[5]研究表明，抑制细胞骨架动力学可阻止中性粒细胞脱粒和形成NETs所需的线粒体DNA释放，解释了细胞骨架动力学在构成NETs中发挥的重要作用。

目前，NETs的释放主要被视为是由外部刺激激活的细胞内在途径驱动的活跃过程[6]。Tatsiy等[7]研究表明，N-甲酰基-甲硫酰基-苯丙氨酸（N-Formyl-Met-Leu-Phe，fMLP）、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte/macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）均为有效的诱导剂。白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）也是很好的诱导剂，但其诱导效果相对较弱。某些中性粒细胞活化剂，如白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）、γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ），几乎不诱导NETs形成，这表明并非所有中性粒细胞刺激物都是NETs诱导剂。

中性粒细胞活化后会产生大量的ROS，这些氧可通过与Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）结合导致中性粒细胞核膜的裂变。细胞内的NE和MPO通过中性粒细胞核膜的分裂迁移到细胞核，在那里它们部分降解特定的组蛋白并促进染色质的缩聚[8]。由肽基丝氨酸精氨酸脱亚氨酶4（peptidylserine arginine deaminase 4，PAD4或PADI4）诱导的组蛋白瓜氨酸化进一步促进染色质缩聚[9]。在此过程中导致PAD4激活的确切机制仍然未知。染色质去浓缩后，松散的染色质与颗粒状细胞质和各种蛋白质混合，然后全部被送出细胞外空间，形成网状结构。

2 NETs形成相关的活性因子

2.1 NADPH氧化酶Fuchs等[10]研究表明，由于慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease，CGD）患者NADPH氧化酶的突变，患者的中性粒细胞在PMA激活后均不能产生ROS，使用ROS抑制剂和从CGD患者中分离出的中性粒细胞的数据表明，需要NADPH氧化酶来触发最终形成NETs的信号。通过NADPH氧化酶生成的ROS不仅是中性粒细胞死后杀死微生物的必需分子，还要充当第二信使来触发NETs的形成。在活细胞成像监测下证实，PMA或细菌诱导的NETs形成途径中，中性粒细胞是通过NADPH氧化酶依赖性机制将蛋白修饰的核DNA释放到细胞外环境中。Nadesalingam等[11]研究表明，高渗氯化钠（NaCl）会抑制由诱导剂PMA、大肠杆菌（Escherichia col，E.coli）和铜绿假单胞菌诱导的NADPH氧化酶的中性粒细胞形成NETs。高渗盐水还抑制E.coil和PMA诱导活性氧的产生。在补充过氧化氢（H2O2）后，逆转了高渗盐水对依赖NADPH氧化酶的中性粒细胞形成NETs的抑制作用。Wang等[12]研究表明，在高葡萄糖诱导NETs形成的过程中，ROS水平显著升高，证明了NADPH氧化酶激活的参与。二苯基氯化碘盐（diphenylene iodonium chloride，DPI）成功抑制了高糖诱导的NETs的形成，表明NETs的形成依赖ROS，高葡萄糖诱导中性粒细胞形成NETs依赖NADPH氧化酶。

2.2 中性粒细胞NE和MPO中性粒细胞激活后，NE从嗜铜颗粒中逸出并易位至细胞核，在其中降解特定的组蛋白，与MPO协同促进染色质的缩聚。Zabieglo等[13]研究表明，外源性和内源性的分泌型白细胞蛋白酶抑制剂（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）都是中性粒细胞形成NETs的有效负调节剂，可对感染和炎症刺激[如金黄色葡萄球菌TNF-α或诱导剂PMA]作出反应，通过抑制NE的生成减少NETs的释放。

Björnsdottir等[14]研究表明，胞外ROS的完全中和不足以阻止PMA触发NETs的形成，这表明胞内ROS对于NETs的形成至关重要。使用MPO抑制剂对NETs形成的抑制与抑制胞内MPO的活性有关，胞外添加MPO不能使完全缺乏MPO的中性粒细胞形成NETs，并且在细胞内由于使用MPO处理过的ROS和鲁米诺特异性中和作用导致PMA触发了NETs形成的完全阻断反应。Odobasic等[15]研究发现，缺乏MPO的中性粒细胞可形成NETs且不能通过添加MPO的细胞外产物来影响NETs形成，这表明MPO可以在细胞中自主发挥作用；另一方面，与NETs结合的MPO对树突状细胞（dendritic cell，DC）的刺激可导致MPO特异性自身免疫产生和抗中性粒细胞胞浆抗体（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）血管炎的发展。

2.3 PAD4在探究中性粒细胞染色质缩聚的过程中，PAD4已经被证实可通过催化组蛋白瓜氨酸化介导染色质缩聚。Wong等[16]研究发现，PAD4介导精氨酸向瓜氨酸转化，导致组蛋白中精氨酸残基的正电荷大量损失，降低了DNA和组蛋白之间的作用力，从而促进了染色质缩合。染色质浓缩过程取决于PAD4的酶活性和足够的细胞内钙浓度，PAD4的过度表达会以与NETs类似的方式在非粒细胞中引起广泛的染色质浓缩。Gordon等[17]研究表明，在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）和增生性肾炎的小鼠模型中，PAD4的缺失对自身免疫反应和靶器官的损伤并没有任何改善，而且在两种独立的ICFcγR介导的肾小球肾炎模型中，使用N-α-苯甲酰基-N5-（2-氯-1-亚氨基乙基）-L-鸟氨酸酰胺抑制PAD对中性粒细胞的聚集或肾小球损伤都没有影响。Guiducci等[18]研究表明，尽管白色假丝酵母菌很容易诱导PAD4介导中性粒细胞组蛋白瓜氨酸化，但对于白色假丝酵母菌菌丝诱导NETs产生的过程PAD4并不是必须的。缺乏PAD4的中性粒细胞具有吞噬细胞的正常能力并响应菌丝产生ROS，在体外具有抗真菌活性。而且，对于在黏膜和全身性白色假丝酵母菌感染期间抗真菌能力的产生也不是必需的。

2.4 自噬性溶酶体最新的研究表明自噬性溶酶体与NETs的形成有密切关系。Sharma等[19]研究表明，自噬性溶酶体和ROS的产生是PMA有效诱导NETs形成的必要条件。抑制自噬性溶酶体或NADPH氧化酶的作用均能阻止染色质的缩合，这对于NETs的形成至关重要。Sil等[20]研究表明，痛风患者中性粒细胞的活化与NETs的形成有关，并且该过程与自噬性溶酶体和IL-1β有关。Itakura等[21]研究表明，药理抑制剂对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性的阻断会增加自噬性溶酶体的活性，并促使中性粒细胞形成NETs。mTOR和细胞骨架机制在调节人中性粒细胞内自体吞噬介导的NETs形成中起关键作用。Xue等[22]研究表明，大肠杆菌O157：H7诱导的蛋白激酶A（PKA）激活抑制了细胞外信号调节激酶1/2（extracellular-signal regulated kinase 1/2，ERK1/2）激活，并增强了磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号传导，从而抑制了自噬信号传导。相反，PKA抑制可防止由于大肠杆菌O157:H7感染而导致ERK1/2信号下调。Ma等[23]研究表明，药理抑制剂或抗自噬相关基因7（autophagyrelated gene 7，ATG7）的小分子干扰RNA可抑制自噬性溶酶体的形成并显著降低中性粒细胞的NETs生成。Xu等[24]研究发现，老年人ATG5的表达水平降低可导致中性粒细胞在TLR2刺激后形成NETs的能力降低，表明自噬性溶酶体在维持NETs机制具有重要作用。Teimourian等[25]研究表明，PI3K/AKT/mTOR通路是自噬性溶酶体的关键调控因子，可通过调控10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）的表达来影响PI3K/AKT/mTOR通路进而影响中性粒细胞NETs的生成。但也可能存在其他调控自噬性溶酶体的途径。

3 NETs形成涉及的信号通路

3.1 Raf-ERK激酶-p38有丝分裂原活化蛋白激酶（Raf-MEK-p38MAPK）信号通路Fonseca等[26]研究表明，溶组织内阿米巴通过Raf/MEK/ERK信号传导通路诱导NETs形成。Grimberg-Peters等[27]研究表明，PMA诱导NADPH氧化酶的激活以产生ROS，然后刺激细胞外调节蛋白激酶（extracellular-signal regulated kinase，ERK）和磷酸化诱导NETs的形成。

Alemán等[28]研究表明，中性粒细胞通过产生许多介质而影响先天性和适应性免疫，这些介质的调节主要取决于核因子κB抑制蛋白激酶/核因子κB抑制蛋白/核因子κB（IKK/IκB/NF-κB）信号级联。在刺激中性粒细胞活化时，阻断活化激酶1（activated kinase 1，TAK1）的活性可减弱细胞核和细胞质IKKα/β的磷酸化，并削弱IκB-α的降解和活化嗜中性粒细胞中NF-κB DNA的结合。TAK1参与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）和ERK的激活，这也影响嗜中性粒细胞细胞因子的生成。

Ma等[29]研究表明，猪链球菌血清型2（streptococcus suis serotype 2，SS2）在2～4 h内可诱导生成NETs，并且依赖于NADPH氧化酶的活性氧，血细胞中SS2感染显著上调了TLR2和TLR4，说明这两个受体与SS2识别有关。阻断TLR4信号传导可进一步抑制ERK1/2的激活，但不能抑制p38MAPK的激活。TLR4信号抑制了SS2诱导NETs的形成。SS2可以被TLR2和（或）TLR4识别，以NADPH氧化酶衍生的ROS依赖性方式启动NETs形成信号通路。ROS将激活p38MAPK和ERK1/2，最终诱导NETs的形成。活化的p38MAPK可能不是SS2诱导的NETs释放过程中的关键分子，或者可能是增强SS2诱导的NETs形成能力的附加信号途径。SS2诱导的NETs形成中p38MAPK和ERK1/2的关系需要进一步研究。

3.2 蛋白酪氨酸激酶（PTK）信号通路Nanì等[30]研究表明，β-葡聚糖颗粒内化后与NETs形成有关的信号传导途径与蛋白酪氨酸激酶非受体型Src家族的Syk激酶和ROS有关。β-葡聚糖颗粒在酪氨酸残基中触发了非受体型Lyn激酶和Hck激酶的磷酸化，酪氨酸残基的磷酸化与激酶活性有关。鼠类缺乏Syk的中性粒细胞的激活机制表明，Syk在触发金黄色葡萄球菌和大肠杆菌以及免疫复合物形成NETs的过程中起重要作用，在缺乏Syk的中性粒细胞中，β-葡聚糖颗粒内化是不完整的，进一步表明Syk通过响应不同诱导剂而调节NETs形成。Silva等[31]研究表明，烟曲霉诱导的NETs释放依赖于蛋白酪氨酸激酶Src家族Syk的活性。尽管烟曲霉促进了组蛋白瓜氨酸化，但是该过程对于烟曲霉分生孢子的NETs释放是必不可少的。烟曲霉诱导的NETs释放需要NADPH氧化酶复合物生成活性氧，在下游途径中需要蛋白酪氨酸激酶Src家族Syk的活性。

3.3 受体相互作用蛋白激酶1-受体相互作用蛋白激酶3-混合系列蛋白激酶样结构域蛋白（RIPK1-RIPK3-MLKL）信号通路Torene等[32]研究表明，TNF诱导凋亡涉及PI3Ks，p38MAPK激活。TNF诱导的PI3K活化导致活性氧产生，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）基因这一机制在没有活性NADPH氧化酶的中性粒细胞中不起作用。在中性粒细胞中，肿瘤坏死因子受体（tumour necrosis factor receptor 1，TNFR1）刺激后的促凋亡途径是由p38MAPK和PI3K启动的。Desai等[33]研究表明，人类和鼠类中性粒细胞在接触尿酸单钠（monosodium urate，MSU）、草酸钙一水合物、磷酸钙、胆固醇、胱氨酸、二氧化硅和石棉后出现凋亡并形成NETs。在抑制剂抑制了RIPK1和MLKL的活性后，MSU晶体或PMA不能诱导人和小鼠的中性粒细胞形成NETs。这些抑制剂不影响PMA或尿酸盐晶体诱导的活性氧生成。慢性肉芽肿患者中性粒细胞缺乏PMA诱导的MLKL磷酸化。小鼠RIPK3基因缺陷可在体内外阻止MSU晶体诱导的NETs形成。中性粒细胞的死亡和NETs的形成可能涉及RIPK1-RIPK3-MLKL信号传导途径。提示RIPK1、RIPK3和MLKL可能是痛风或其他晶体病的分子靶点。

4 NETs与生殖相关疾病

Gomez-Lopez等[34]研究表明，在羊膜内存在感染的患者羊水中，羊水内的中性粒细胞形成了NETs。所有羊水样本中都有可检测到的与NETs有关的活细菌和死细菌，与母体循环产生的中性粒细胞相反，羊水中性粒细胞不需要PMA刺激即可形成NETs，通过将弹性蛋白酶，组蛋白H3和DNA共定位在羊水中性粒细胞中可以观察到NETs形成的不同阶段。这一发现为羊水内中性粒细胞杀死侵入羊膜腔的微生物提供了一种新的免疫防御机制。Hu等[35]研究表明，内皮细胞微粒（microparticles，MPs）是子痫前期患者体内NETs生成的主要刺激物。结合之前已经报道的低氧胎盘中促炎蛋白与母体内皮损伤和MPs产生有关，证实来自缺氧胎盘的促炎蛋白刺激母体内皮细胞产生MPs，进而在母体循环中诱导NETs生成。高水平的NETs会促进血液凝结，进而促成子痫前期患者常见的高凝状态。这些研究应有助于确定靶向中性粒细胞活化是否可以作为预防或治疗子痫前期血栓形成的治疗策略。Barr等[36]研究表明，用HIV病毒样颗粒（HIV-VLP）刺激女性生殖道中性粒细胞可在病毒暴露后的几分钟内诱导NETs的释放，通过不依赖ROS的机制立即捕获HIV-VLP，将感染性HIV与预先在生殖道中形成的NETs一起培养可造成病毒不可逆失活。表明NETs可迅速拦截和灭活HIV且不可逆，是防止性接触后黏膜细胞感染HIV的有效机制。在女性生殖道中NETs灭活HIV可能代表了黏膜保护在预防HIV感染的一种前所未有的形式。