冉建新 胡等慧 王晓杰

1.北京市第六医院药剂科，北京 100007；2.北京中医药大学中药学院，北京 102488；3.北京电子科技职业学院生物工程学院，北京 100176

失眠又称为睡眠障碍（sleep deprivation，SD），是指睡眠时间和质量下降不能满足人们日常社会活动的一种睡眠障碍综合征[1]，属中医范畴内“不寐”“不得眠”“不得卧”等，是目前临床较为难治的疾病之一[2-3]。酸枣仁、五味子两药在中医经典安神方剂中多配伍使用，是临床常用的安神药对之一，具有滋阴养血、安神镇惊、消除疲劳等功效，可用于各种与失眠有关的病症，如神经衰弱等[4-10]。北京市第六医院（以下简称“我院”）临床应用酸枣仁-五味子混合粉末口服给药的镇静催眠效果较为理想，与文献报道相一致；但二者最佳配比，未见有相关报道[11-13]。鉴于此，选取临床常用的酸枣仁-五味子3 个配比（15 g∶6 g、12 g∶6 g、6 g∶6 g）进行考察，筛选方便、安全、高效的半仿生提取法的提取工艺参数。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备仪器

1.1.1 试剂

酸枣仁、五味子购买于河北安国药材市场；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：WS20060 401）；艾司唑仑（山东信谊制药有限公司，批号：180905）；谷氨酸（Glu，货号：CSB-E05129r）、γ-氨基丁酸（GABA，货号：SA8240）、谷氨酰胺（Gln，货号：CSB-E12692h）、5-羟色胺（5-HT，货号：CSB-E14956r）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA，货号：CEB005Ge-2），上述酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购于上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.2 设备仪器

VT05404-0998 全自动酶标仪（美国伯腾仪器公司）；YY/T0657-2008 高速冷冻离心机（湖南赫西仪器公司）；KQ-250E 多功能粉碎机（铂欧五金厂）；DHG-9030A（101）电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）；S1-2002 电子天平（丹佛仪器有限公司）。

1.2 实验动物

SPF 级昆明种小鼠购于北京斯贝福实验动物有限公司，雄性，5 周龄，体重（25±5）g，合格证号：SCXK9（京）2017-0002。实验动物喂养环境：SPF 级动物房，自由饮水，相对湿度：40%～70%，室温：20～26℃。

1.3 实验方法

1.3.1 酸枣仁-五味子配比筛选

1.3.1.1 供试品溶液的制备 根据2015 版《中华人民共和国药典》一部[4]规定人体临床用量及我院常用的配比进行分析，确定制备3 份不同配比的供试品溶液，其中酸枣仁与五味子配比依次为：15 g∶6 g、12 g∶6 g、6 g∶6 g。模拟临床使用中所采取的酸枣仁-五味子混合粉末口服的给药形式，上述不同配比药物打粉制备混悬液以备实验使用。

1.3.1.2 实验分组及给药 依据随机数字表法，将50 只小鼠分为空白组、阳性药组、酸枣仁：五味子（15 g∶6 g）组、酸枣仁：五味子（12 g∶6 g）组、酸枣仁：五味子（6 g∶6 g）组，每组10 只。空白组给予蒸馏水，阳性药组给予0.13%艾司唑仑水溶液，给药组给予相应配比混悬液，连续给药14 d。

1.3.1.3 阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠 各组小鼠适应性3 d 后，于实验第1 天开始灌胃给予药物，给药60 min 后，腹腔注射阈下浓度戊巴比妥钠，0.1 mL/10 g，观察30 min 内入睡小鼠只数（翻正反射消失1 min以上）。

1.3.1.4 阈剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠 试验期间每天定时给药，第13 天，各组小鼠灌胃给予对应药物60 min 后，腹腔注射阈上浓度戊巴比妥钠，0.1 mL/10 g，计算各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间（以注射后小鼠翻正反射消失为入睡指标，小鼠翻正反射恢复为苏醒指标）。

1.3.1.5 小鼠大脑内GABA、Glu、Gln、5-HT 和5-HIAA含量检测 试验最后1 d，5 组小鼠给药60 min 后注射阈剂量戊巴比妥钠，12 h 后处死，制备10%的脑组织液，按照试剂盒说明书严格操作，分别测定脑组织液中GABA、Glu、Gln、5-HT 和5-HIAA 含量。

1.3.2 半仿生提取工艺优化

1.3.2.1 Box-Behnken 响应面法实验设计 将上述筛选得到的药对配比，进行半仿生提取工艺的优化。根据前期预实验结果，利用BBC 设计原理，选取人工胃液的用量和提取时间，人工肠液的用量和提取时间4 个为自变量为考察因素，以GABA 和5-HT 的综合评分为响应值，设计四因素三水平的响应面优化实验，见表1。利用Design-Expert 软件进行响应面分析，确定酸枣仁与五味子半仿生提取工艺的最佳条件。

表1 四因素三水平中心组合实验因素水平编码表

1.3.2.2 供试品溶液的制备及分组给药 参考上述实验，选取GABA 和5-HT 为考察指标，设计药效试验，操作同上，每组5 只小鼠，将仿生提取液减压浓缩为1 g/mL 灌胃给药，于第14 天末次给药60 min 后处死，制备脑组织液，测定GABA 和5-HT 含量。

1.4 统计学方法

采用SAS 8.2 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 酸枣仁、五味子配比筛选结果

2.1.1 阈下剂量戊巴比妥钠对各组小鼠入睡的影响

与空白组比较，阳性药组、15 g∶6 g 组、12 g∶6 g组以及6 g∶6 g 组小鼠入睡率均有一定程度提高，其中以阳性药组疗效最佳，15 g∶6 g 组次之，12 g∶6 g 及6 g∶6 g 组效果相近。见表2。

表2 阈下催眠剂量戊巴比妥钠对各组小鼠入睡的影响

2.1.2 阈剂量戊巴比妥钠对各组小鼠睡眠时间的影响

与空白组比较，阳性药组、15 g∶6 g 组以及6 g∶6 g组小鼠睡眠潜伏期明显缩短、睡眠持续时间明显延长，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。与阳性药组比较，12 g∶6 g 组睡眠潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与15 g∶6 g 组比较，12 g∶6 g 组睡眠潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 阈剂量戊巴比妥钠对各组小鼠睡眠的影响（min，）

表3 阈剂量戊巴比妥钠对各组小鼠睡眠的影响（min，）

注：与空白组比较，*P ＜0.05、**P ＜0.01；与阳性药组比较，#P ＜0.05；与15 g∶6 g 组比较，△P ＜0.05

2.1.3 药物对各组小鼠脑组织GABA、Glu及Gln含量的影响

与空白组比较，阳性药组和15 g∶6 g 组小鼠脑内GABA 含量增加、Glu 和Gln 含量减少，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。与阳性药组比较，12 g∶6 g 组和6 g∶6 g 组GABA 含量减少、Glu 和Gln 含量增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与15 g∶6 g 组比较，12 g∶6 g 组GABA 含量减少；6 g∶6 g 组Gln 含量增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表4。

表4 药物对各组小鼠脑组织中GABA、Glu 及Gln 的影响（）

表4 药物对各组小鼠脑组织中GABA、Glu 及Gln 的影响（）

注：与空白组比较，*P ＜0.05、**P ＜0.01；与阳性药组比较，#P ＜0.05；与15 g∶6 g 组比较，△P ＜0.05。GABA：γ-氨基丁酸；Glu：谷氨酸；Gln：谷氨酰胺

2.1.4 药物对各组小鼠脑内5-HT 及5-HIAA 的影响

与空白组比较，阳性药组、15 g∶6 g 组、12 g∶6 g组和6 g∶6 g 组的5-HT 含量增加，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。与阳性药组比较，12 g∶6 g组5-HT 含量减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与15 g∶6 g 组比较，12 g∶6 g 组5-HT 含量减少，差异统计学意义（P ＜0.05）。与空白组比较，阳性药组5-HIAA 含量减少，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与阳性药组比较，15 g∶6 g 组、12 g∶6 g 组、6 g∶6 g 组5-HIAA 含量增加，差异有统计学意义（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表5。

表5 药物对各组小鼠脑组织中5-HT 及5-HIAA 的影响（pg/g，）

表5 药物对各组小鼠脑组织中5-HT 及5-HIAA 的影响（pg/g，）

注：与空白组比较：*P ＜0.05，**P ＜0.01，与阳性药组比较：#P ＜0.05；与15 g∶6 g 组比较，△P ＜0.05。5-HT：5-羟色胺；5-HIAA：5-羟吲哚乙酸

综上所知，酸枣仁与五味子不同配比均能对小鼠起到一定的镇静催眠作用，其中以15 g∶6 g 组疗效最好，6 g∶6 g 组次之，12 g∶6 g 组最差，且6 g∶6 g 组与12 g∶6 g 组效果与15 g∶6 g 组相差较大，最终确定15 g∶6 g 组为最佳配比。

2.2 半仿生提取工艺优化结果

根据预实验结果，利用Box-Behnken 中心组合实验的设计原理，设计四因素三水平的29 个实验点。各实验点GABA 和5-HT 的含量测定结果见表6。

2.2.1 回归模型的建立与拟合

采用Design-Expert 软件对上面数据进行分析，以Y 对变量进行模型拟合，并通过系数（R2）等对拟合自模型进行评价，通过比较各拟合方程的拟合度，建立四元二次回归方程Y=0.98+0.052A+0.0075B-0.0008C+0.025D+0.010AB+0.012AC+0.013AD+0.0075BC-0.060BD-0.022CD-0.042A2-0.059B2-0.051C2-0.068D2，运用Design-Expert 软件对上述实验点的响应值进行方差分析。

由表7 可以看出，回归模型P ＜0.01，F=11.41，提示模型具有高度差异性，同时该模型具有较高的相关系数（R2=0.9194），拟合度大于90%，且失拟值P >0.05，说明该模型能够反映响应值的变化，误差小，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。

表6 四因素三水平中心组合实验方案与结果

表7 方差分析

2.2.2 效应面优化分析

用Design-Expert 8.2.0 软件对表6 实验结果拟合分析，所得响应面等高线曲面图，见图1。曲面陡表明该因素对综合评分影响显著，曲面平缓则表明该因素对综合评分影响不显著。

由图1 可以看出，A、B、C、D 四个因素对综合评分的影响均成抛物线关系。分析各图，从图①可以看出，A 曲面较陡，B 曲面较平缓，说明人工胃液的用量对综合评分的影响显著，而提取时间的影响不显著。同理，从图②可以看出，A 对综合评分影响显著，C 影响不显著；从图③可以看出，A 对综合评分影响显著，D 影响较显著；从图④可以看出，B 影响不显著，D 影响较显著；从图⑤可以看出，B 和D 二者的提取时间交互作用显著，说明BD 项对综合评分影响显著；从图⑥可以看出C 不显著，D 较显著。

综上可知，影响半仿生提取的主要因素为A，其次为D，其中以B、D 交互作用最为显著。

图1 A、B、C、D 四因素等高线图和响应面图

2.2.3 提取工艺优化结果及验证试验

根据回归模型分析可知，半仿生提取的最佳条件为：第1 次提取人工胃液用量9.45 倍、时间2.43 h；第2 次提取人工肠液用量6.02 倍、时间3.65 h。按照优化的处方剂量，结合实际操作情况，各因素值保留为整数，即第1 次提取人工胃液用量9.5 倍、时间2.5 h，第2 次提取人工肠液用量6.0 倍、时间3.6 h。在此条件下，按照中试规格要求，药材用量采用处方量1000 倍进行3 次平行实验，见表8。GABA 和5-HT 的含量的平均值分别为216.60 ng/g 和3508.11 pg/g，与理论值221.21 ng/g 和3533.38 pg/g 比较接近。说明该回归方程与实际情况拟合较好，该最佳工艺切实可行，可操作性强。

表8 验证试验表

3 讨论

中药药对配伍是基于中医基础理论将两味药合用，通过药物间的复杂配伍作用，有机地组合而成。酸枣仁与五味子药对配伍以酸枣仁为主，但最佳配伍比例并不确定，本实验基于镇静催眠作用筛选酸枣仁-五味子的最佳配比。结果显示，酸枣仁与五味子不同配比均能对小鼠起到一定的镇静催眠作用，其中以酸枣仁：五味子（15 g∶6 g）疗效最好，12 g∶6 g 组、6 g∶6 g 组疗效虽然相差无异，但6 g∶6 g 组耗费药材少。综合分析可知：15 g∶6 g 组配比虽然用量大，但疗效最佳，6 g∶6 g 组虽然给药量小但效果等同于12 g∶6 g组，不及15 g∶6 g 组，又因五味子每天最大给药量上限为6 g，故最终确定最佳配比为15 g∶6 g。

Glu 能够在相应合成酶谷氨酰胺的作用下转变成Gln，属于人体内少有的兴奋性氨基酸；而GABA属于抑制性氨基酸，部分镇静催眠药物的发挥作用主要与加强GABA 功能有关[15-17]。同时，神经递质5-HT及其代谢产物5-HIAA 两者变化也可影响人体的睡眠[18-19]，所以本研究除上述3 种物质外，也同时测定5-HT、5-HIAA 含量，以判断酸枣仁-五味子不同配比的镇静催眠作用。

半仿生提取法是一种新的中药提取技术，该法模拟胃肠道环境，采用接近于胃肠道PH 的酸性溶液和碱性溶液依次提取，提取简便、不破坏有效成分、提取率高，能在一定程度上节约成本，较一般提取法的有效成分含量更高[20-22]；而且经历了模拟胃肠道环境的处理，生物活性有所增强，口服不存在胃肠道破坏情况。另外，酸枣仁五味子单独提取时，采用半仿生提取法的镇静催眠效果明显优于传统提取法[23-25]。