张 荣，李 菁，武永淑，李小明，董金杰，安芳兰，刘学荣

（中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046）

佐剂在动物和人疫苗技术中起着非常重要的作用，目前已有许多有机、无机、合成和天然来源的化合物证明具有刺激免疫反应和有效佐剂特性的能力。其大致可以分为2类：免疫增强剂类（Toll样受体激动剂，皂苷，细胞因子）和递送剂类（乳剂，微粒，矿物盐）[1]。免疫增强剂刺激抗原递呈细胞（APCs）促进各种细胞因子的分泌，而递送剂可以保存抗原的构象并将其递送给APCs，并为抗原的缓慢释放提供持续的免疫刺激。例如，TLR激动剂和其他免疫刺激物质可增强免疫细胞的募集和细胞因子的分泌，而乳剂和矿物盐可在注射部位产生存储效应，延长抗原的释放时间并持续刺激免疫细胞。

因为涉及成本效益，食用动物疫苗的研发不同于人和其他动物疫苗。从安全出发，例如在人类疫苗中Quil-A和矿物油乳剂等化合物是被限制使用的，但已被广泛运用于畜牧业疫苗中[2]。本文重点对商业化疫苗佐剂和目前正在研究的动物疫苗佐剂进行了概述，并探讨了佐剂之间的协同效应及其作用机制。

1 矿物盐

铝盐是最早用于疫苗的佐剂之一，能诱导高滴度的IgG抗体，且作用时间相对较长，易于配制。铝佐剂可以促进白细胞介素分泌刺激Th2免疫应答的细胞因子IL-4，从而诱导IgG1和IgE免疫球蛋白以及嗜酸性粒细胞的产生，因此成为抗菌和抗寄生虫疫苗的理想候选佐剂。为了提高铝盐对抗病毒性疾病的有效性，它与其他佐剂联合给药以刺激Th1细胞介导反应的策略已在许多研究和临床试验中使用[3]。铝佐剂广泛运用在商用的人和动物疫苗中，可以预防具有重要经济意义的动物疫病，如新城疫和口蹄疫（FMD）等。

磷酸钙是另一种市售矿物盐佐剂，已运用在对抗各种类毒素和病毒病原体的疫苗生产中。与铝佐剂相比，磷酸钙对局部组织的刺激较小，IgE抗体产生减少。在小鼠和豚鼠模型中，用磷酸钙纳米颗粒给药的DNA疫苗可诱导足够的体液和细胞介导的免疫应答，以保护动物免受口蹄疫的致死感染，以磷酸钙为佐剂的新城疫灭活疫苗产生保护性免疫的效果低于以天然高分子壳聚糖为佐剂的疫苗[4]。

矿物盐类佐剂在人类和动物疫苗学研究中具有较长的历史，是相对安全和经济的一类佐剂[5]。虽然在对抗细胞外病原体的疫苗中表现出良好的佐剂性能，但在针对细胞内细菌感染的疫苗中的应用却有限。

2 乳剂

当2种不混溶的液体混合在一起时就形成了乳剂，其中一种可以组成小液滴，分散在另一种液滴中，并由两者界面上的表面活性剂层来稳定其结构。因为其相对易生产，成本较低，并在产生抗体的应答中表现出良好的效能，所以乳剂是动物疫苗佐剂的一个优良选择。

不同类型的乳剂在疫苗中的作用机制也不同，油包水（W/O）乳剂是水滴在连续油相中的分散体，抗原被包裹在水相中，周围是连续的油相，注入机体后随着油的分解缓慢释放，可以延长免疫细胞募集和抗原加工的时间。最典型的W/O型佐剂是弗氏佐剂，它可以有效诱导高效价抗体应答，但会产生强烈的不良反应，如局部炎症病变和疼痛等，限制了其在动物和人疫苗中的广泛应用。法国SEPPIC公司的Montanide（ISA）佐剂是做得最好的商业化W/O乳剂，ISA含有提纯的矿物油或角鲨烯油，与甘露醇酯作为乳化剂，副作用小，被广泛用于兽用疫苗的生产和研发。例如在鸡新城疫疫苗和猪肺炎支原体亚单位疫苗、猪和牛灭活口蹄疫疫苗以及由各种病毒和细菌感染的养殖鱼类疫苗中使用的都是Montanide的W/O佐剂[6]。

对于水包油（O/W）乳剂，油滴分散在水相中，与W/O乳剂不同的是，O/W乳剂在注射部位不会形成抗原库。O’Hagan DT等[7]对MF59（一种角鲨烯O/W疫苗佐剂）的研究揭示了O/W乳剂诱导免疫应答的机制，与氢氧化铝和磷酸钙相比，在对流感病毒刺激细胞免疫反应中，MF59具有更好的适应性。在兽医应用中，一些商业化的O/W佐剂被广泛用于家畜疫苗的制备中，来抵抗各种具有经济意义的细菌和病毒引起的疾病[8]。Horohov DW发现[9]与以磷酸铝为佐剂的灭活马流感疫苗相比，MetaStim对IL-12和IFN-γ的表达有较高的促进作用。因此，与无机盐相比，O/W乳剂是更适合用于对抗病毒病原体的疫苗佐剂。

在双相乳剂水包油包水（W/O/W）中，含有内部水滴的油滴分散成连续的水相，这种乳剂可以同时提供抗原从外部水相的快速释放和从内部水相的延长释放，可以快速、持续地刺激免疫细胞。目前市场上的W/O/W型乳剂还比较少，兽用疫苗中应用最广泛的就是Montanide ISA 201和Montanide ISA 206，与抗原在温和条件下混合后制备疫苗，保护不同种类的牲畜免受几种经济上重要的病原体（如流感病毒和口蹄疫病毒）感染[10]。

乳剂是兽用疫苗中非常有前景和市场的佐剂，该佐剂的成分廉价、较易获得，如矿物油和食品级乳化剂，但乳剂的物理特性与其诱导动物免疫反应的能力之间的关系还需要进一步研究。

3 Toll样受体激动剂

TLRs是在巨噬细胞和树突状细胞中表达的膜附着受体，能够识别微生物的特定成分并启动宿主固有的防御机制。某些细菌来源的成分可以诱导特异性免疫反应，TLRs的激活可以通过诱导特定细胞因子的表达，参与抗原特异性免疫来诱导T细胞的分化。

脂多糖（LPS）是一种TLR4激动剂，能刺激APCs分泌激活Th1细胞的细胞因子，如IL-1β、IL-12、IL-18等，这些细胞因子介导细胞免疫和体液免疫，对抗病毒和其他细胞内的病原体。细菌脂蛋白被TLR2识别，Rau H等[11]在CSF亚单位疫苗中使用铜绿假单胞菌膜脂蛋白OprI，OprI通过TLR2介导的APCs的激活和成熟促进T细胞应答和体液反应。细菌鞭毛蛋白是一种TLR5激动剂，具有佐剂特性，Qi Y等[12]将细菌鞭毛蛋白与狂犬病毒样颗粒联合使用时，鞭毛蛋白和不耐热细菌肠毒素均能促进病毒特异性中和抗体和CD4+、CD8+T细胞的产生。将大肠杆菌不耐热肠毒素作为亚单位猪流感疫苗的佐剂，TLR9能够识别细菌DNA中的CpG基序，并诱导T细胞免疫，CpG寡脱氧核苷酸（ODNs）与TLR9相互作用，通过诱导IL-12和IFN-γ刺激Th1应答[13]。细菌菌影（BGs）是由革兰氏阴性菌的细菌空壳制备的非活细胞，是基于TLR激动剂的另一种佐剂，不含保留细胞形态的细胞质内容物和表面抗原。Xia S等[14]用含有BG佐剂的嵌合载体疫苗rAdV-SFV-E2治疗的猪对CSF病毒的攻击具有完全保护，不含BG的疫苗对猪的保护作用有限，但是用添加BG佐剂的疫苗免疫猪，猪会产生短暂的过敏反应。

虽然TLR激动剂在兽药疫苗技术中广受研究者的关注，但其在应用上也面临着巨大的挑战。通过病原体识别受体（PRRs）过度激活先天免疫系统可导致败血性休克，与FIA相比，FCA中热杀灭分枝杆菌的存在能促进更高的抗体反应，但用重组细菌鞭毛蛋白与O/W乳剂联合应用于抗恶性卡他热疫苗，可在牛中诱导免疫抑制机制，与未接种鞭毛蛋白疫苗相比，死亡率更高[15]。因此，在安全性和有效性之间找到正确的平衡是今后佐剂研究面临的挑战。

4 免疫反应化合物

4.1 细胞因子

细胞因子是TLR激动剂介导的免疫反应的关键因子，在动物疫苗中使用细胞因子作为疫苗佐剂正在进行更深入的研究，这些小蛋白在细胞信号传导、诱导和指导细胞免疫和体液免疫应答中起着至关重要的作用。例如，IL-2、IL-12和IFN-γ可促进Th1细胞介导细胞免疫应答；IL-4、IL-5和IL-10可促进Th2细胞的发育和抗体的产生，防御细胞外病原体；IFN-γ还可通过诱导APCs上主要组织相容性复合体（MHC-II）分子的表达，增强抗原的摄取和递呈[16]。Fan Y等[17]用IFN-γ作为佐剂制备CSF减毒疫苗免疫猪，与单独接种减毒疫苗组进行比较，可显著提高抗CSF病毒IgG抗体水平，并增加MHC-I和MHC-II的表达。

细胞因子还用在家禽、牛和鱼类的各种病毒性疾病的疫苗生产中，Huo S等[18]在新城疫疫苗中加入了IL-18和在传染性法氏囊病DNA疫苗中加入了IL-7。IL-18可用作牛口蹄疫DNA疫苗的佐剂，诱导牛细胞介导的抗体应答。Chang C等[19]发现用含有鲑鱼贫血病毒蛋白和鱼I型干扰素的DNA疫苗免疫大西洋鲑鱼，与未使用细胞因子的DNA疫苗相比，可诱导更高水平的抗体及B细胞和CD8+T细胞的流入和汇集。

4.2 皂苷

皂苷是由亲脂性三萜衍生物上附着的一种或多种亲水糖苷基组成的两亲性化合物，这些天然物质在许多医药行业中都有应用，皂苷具有刺激免疫反应的能力，因此可以作为动物疫苗佐剂。应用最广的皂苷佐剂是Quil-A，它是一种水溶性皂苷的非均相混合物，从南美洲本土的一种树中提取，由于毒性较强，Quil-A不适合用于人类疫苗，却被广泛用于兽用疫苗。研究证明，在口蹄疫和猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的疫苗中，添加Quil-A的疫苗跟未添加Quil-A的疫苗相比，免疫原性显著增强[20]。QS-21是皂苷的纯化部分，作为佐剂正用于许多人类癌症和传染性疫苗的临床试验中，一种商业化的猫白血病疫苗中也使用了QS-21。

Quil-A和QS-21通过刺激Th1和细胞毒淋巴细胞引起细胞介导的免疫反应，诱导小鼠产生IgG1和IgG2a抗体。在研究皂苷的结构成分与其免疫功能之间的相互联系方面已做了大量工作，皂苷的糖基可以与APCs上的凝集素结合，促进抗原吞噬和刺激APCs分泌细胞因子，激活体液和细胞介导的免疫应答。对于家畜应用而言，在自然界中寻找毒性较小的皂苷类化合物在经济上更可行。

4.3 聚合物

聚合物除了在疫苗中作为运载工具保护抗原，并在注射后提供可控释放外，有些还可以作为免疫增强剂，本文主要列举一些具有免疫活性可作为兽用疫苗佐剂的天然和合成高分子物质。壳聚糖在疫苗中主要作为抗原颗粒载体出现，对其免疫特性进行研究发现，壳聚糖分子可以与巨噬细胞上的甘露糖受体结合激活炎性小体，启动补体途径。Pan L等[21]用含壳聚糖佐剂的口蹄疫疫苗滴鼻免疫牛，可防止口蹄疫病毒的直接接触感染。

聚丙烯酸聚合物（Carbomers）如Carbopol，它的佐剂特性首次在小鼠接种试验中得到验证，目前作为佐剂应用于抗马流感病毒、抗猪圆环病毒2型疫苗与肺炎支原体疫苗等灭活疫苗和基于载体的获批疫苗中。Mair KH等[22]发现Carbopol可有效促进猪接种改良PRRS病毒活疫苗后IFN-γ的产生和T细胞的分化。此外，Carbopol能够捕获并缓慢释放刺激免疫细胞的抗原分子。

聚磷腈是一类主要由磷和氮原子交替组成的无机—有机聚合物，代替抗原库效应，聚磷腈聚合物倾向于与抗原分子形成非共价键，有助于抗原递送到APCs，使得在注射部位促炎细胞因子和趋化因子的分泌增加。虽然聚磷腈在实验动物中结果较好，但要在畜牧动物中大量使用数据仍有限。Dar A等[23]发现，与O/W乳剂疫苗相比，聚磷腈佐剂胸膜肺炎放线杆菌疫苗能提高猪IgG抗体滴度和IFN-γ的产量，并且在猪的注射部位不会引起炎症。

由于聚合物比乳化剂更安全，并能诱导细胞介导的免疫反应，这对宿主抵御病毒病原体非常重要。因此，聚合物在兽用疫苗预防病毒感染中是非常有潜力的候选佐剂。

4.4 组合佐剂

在一种疫苗中同时使用2种或2种以上的佐剂可增强免疫效果，将几种佐剂联合使用已经处于人类和动物传染病疫苗临床试验的不同阶段，Ren J等[24]评估了细菌CpG基序与O/W或W/O/W乳剂结合作为禽流感和FMD疫苗佐剂系统的效果，发现与单独使用这些佐剂相比，组合佐剂可以诱导更高水平的中和抗体，乳剂可持续释放抗原和CpG ODNs，从而激活IFN-γ分泌淋巴细胞。皂苷和乳剂的组合使用能提高口蹄疫疫苗的效力，用含有QS-21的W/O/W乳剂疫苗免疫奶牛，QS-21可加速抗FMDV中和抗体的产生。用皂苷和乳剂的组合佐剂制备口蹄疫疫苗免疫小鼠，Song X等[25]发现会诱导产生更高滴度的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体。

虽然增强免疫效果的组合佐剂已经在实验室得到验证，但还需要进一步研究来确认其在大型动物中的安全性和有效性。此外，必须彻底评估不同佐剂对生产成本的影响，才能将其应用于商业化动物疫苗中。

5 结语

本文详细阐述了矿物盐、乳剂、Toll样受体激动剂、免疫反应化合物及聚合物等几种商业化佐剂的主要成分、作用机理、应用范围及适宜动物等。许多天然和合成物质都有提高动物疫苗免疫效力的作用，可以作为佐剂使用。其中铝化合物、乳剂、皂苷和卡波姆已经在部分特许产品中商业化使用，而其他像细胞因子和聚磷腈等仍在实验室阶段。因此，在动物疫苗佐剂的选择中应考虑以下几个因素：对目标动物的有效性、诱导一种快速并持久的保护性免疫、对动物的安全性、是否符合食品安全法规、扩大生产的可行性、成本效益等。由此看来，寻找合适的佐剂或其组合以满足以上因素是未来动物疫苗开发中面临的重要挑战。