冼群泽 季兴华 霍建忠 葛军勇 郭耀

1.山西医科大学，山西 太原 030000 2.山西白求恩医院，山西 太原 030000

1 骨质疏松的发病机制与治疗现状

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种由多因素引起的以单位体积骨量减少，骨组织微结构破坏为特征，从而导致骨脆性增加，骨折风险增高的全身性骨代谢疾病[1]。人体的骨骼时刻在经历动态的变化过程，旧的骨质不断被破骨细胞所产生的单核巨噬细胞吸收降解，而新骨则由来源于骨髓间充质干细胞的成骨细胞重塑。虽然各类骨质疏松的发病机制有所不同，但最终都表现为破骨细胞和成骨细胞活动失衡导致的骨重建平衡的破坏，从而使骨吸收速度超过骨形成速度[2]。因此，促进新骨形成以补充丢失的骨组织是治疗此类疾病的关键。目前，临床上对于OP患者多采用药物治疗、物理治疗和运动疗法[3-5]。尽管对骨质疏松的治疗取得了很大进步，但其治疗效果仍难达到临床预期，一方面很多新研发抗骨质疏松药物价格昂贵，普通人难以承受，限制了其在临床上的广泛应用；另一方面患者依从性差，不良反应较多[6-7]。近年来，越来越多的学者开始关注骨髓间充质干细胞与骨质疏松的相关性研究，骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞并进一步形成骨细胞，是机体内骨组织更新的唯一途径，研究表明，MSCs数量的减少或成骨功能的缺失，会直接引起OP[8-9]。因此，通过系统或局部移植正常功能的BMSCs并促进向成骨方向分化，是其治疗OP的关键。

2 骨髓间充质干细胞概述

Friedenstein等[10]首次在骨髓中发现骨髓间充质干细胞，这种细胞贴壁生长，呈梭形，能形成单细胞来源的集落。BMSCs广泛存在于中轴骨及外周骨松质骨骨髓腔中，能够自我更新并分化成多种细胞类型，是当前组织工程研究理想的种子细胞。无论从动物模型还是人体试验，BMSCs的应用都涉及很多疾病，包括骨关节炎、血管修复、骨折愈合、骨质疏松症等[11-13]。骨质疏松患者MSCs的增殖、成骨分化能力均下降，但通过移植骨髓间充质干细胞则为治疗骨质疏松开辟了新领域。研究表明移植骨髓间充质干细胞促进骨再生，改善骨质量主要通过两种机制起作用：(1)骨髓间充质干细胞向受损部位或病理区域归巢，然后分化成骨细胞，合成新的骨组织，修复退化组织；(2)骨髓间充质干细胞通过分泌某些生长因子，改变周围微环境，并招募其他相关细胞，以旁分泌的方式作用修复退化组织[14-15]。体外培养的间充质干细胞最多可达到15～30个群体倍增[16]。而大规模的体外扩增会导致BMSCs增殖和分化能力的丧失，Mandana等[17]通过体外培养不同年龄段的人体骨髓间充质干细胞发现，随着传代次数的增加，细胞的增殖能力逐渐减弱，分化潜能从第6代开始下降，端粒酶的长度也逐渐出现磨损，推测端粒缩短与细胞的衰老有关。Samantha等[18]发现，细胞的增殖能力在第7代开始出现下降，不同的是随着时间的推移，端粒的长度及线粒体活性保持稳定，低代与高代细胞之间并无显著差异。因此，对于端粒酶的缩短是否与BMSCs细胞的衰老有关，目前还存在争议。从活体内提取间充质干细胞的数量总是有限的，必须通过体外扩增，以达到足够治疗数量的BMSCs。尽管BMSCs能够自我更新，有很强的增殖能力，但是有限的增殖寿命也一定程度上限制了骨髓间充质干细胞的进一步应用。

3 BMSCs移植治疗OP的可行性

骨髓间充质干细胞的增殖能力及移植的存活率和植入率是影响骨髓间充质干细胞治疗效果的主要因素。因此，提高移植细胞的存活率、开发高质量可靠的体外MSC培养物、选择合适的移植方法、促进细胞归巢等是促进BMSCs治疗骨质疏松效果的关键。

3.1 提高移植细胞的抵抗性与存活率

BMSCs移植到体内却要面临着缺血缺氧，缺乏营养物质的病理环境，移植后氧化应激作用可在局部区域介导间充质干细胞大量凋亡，降低其存活率，影响治疗效果。Robert等[19]于1983年首先提出“适应性细胞保护”的概念，即细胞在低于生理阈值的应激刺激条件下，可通过调节自身稳态提高对抗应激刺激的耐受性。有学者尝试通过对体外培养的细胞低氧预处理，提高移植细胞的耐受性。Meng等[20]将体外培养的BMSCs分为正常培养组(20%O2)和缺氧培养组(1%O2)，检测细胞的凋亡和迁移，结果显示低氧预处理组骨髓间充质干细胞的迁移和存活率明显高于正常培养组。一定程度的缺氧处理能提高BMSCs的存活率、增殖能力、促进BMSCs的多能性，而研究重点在于优化最合适的氧浓度以提高BMSCs的细胞活性和治疗效果[21]。另外，Zhou等[22]将维生素C化学修饰到三维石墨烯泡沫材料上，研究其对人骨髓间充质干细胞成骨的调节作用，发现维生素C对氧化应激所致的成骨抑制有明显的保护作用，能显著提高BMSCs的成骨能力。无论是正常BMSCs还是经过氧糖剥夺诱导的间充质干细胞，在经过脂多糖预处理后均可提高BMSCs的存活率及迁移能力，这可能与脂多糖预处理促进血管内皮生长因子(VEGF)表达及激活Toll样受体，增强细胞对缺血缺氧适应性有关[23-24]。三维或3 D培养模型模拟靶组织内复杂的环境，与传统的二维培养相比，三维培养技术增强了细胞间的相互作用，促进抗凋亡基因的表达，有助于提高移植细胞的存活率[25-26]。

3.2 基因修饰或细胞表面修饰

通过对BMSCs进行基因修饰或细胞表面修饰等手段，可以促进细胞的归巢，提高存活率。骨形态发生蛋白(BMP)属于转化生长因子，能够刺激诱导BMSCs成骨分化，促进成骨细胞成熟，提高细胞成骨活性。Ruan等[27]发现，慢病毒介导转染的BMP-2在体外能提高BMSCs活力，诱导成骨相关基因的表达，促进成骨分化。肝细胞生长因子(HGF)能够提高成骨相关基因的表达，促进成骨分化，提高细胞归巢效率[28-29]。此外，通过对BMSCs表面进行修饰、靶向改造也能提高细胞的归巢效率。这种方法主要利用酶修饰、化学偶联或非共价相互作用、生物特异性识别(抗原抗体或配体受体)等。例如，CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子的特异性受体，通过促进细胞膜表面高表达CXCR4，能明显促进MSC的归巢，提高移植细胞治疗效果[30]；P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)重组的MSCs能够促进抗炎细胞因子白细胞介素-10(IL-10)的靶向传递，提高BMSCs的归巢效果[31-32]。相比于基因修饰，细胞表面修饰避免了细胞长期安全性和毒性问题，其主要通过增强MSC的粘附和植入，而不影响其存活能力、多能性、增殖和分化潜能[33-34]。

3.3 选择合适植入途径或联合使用生物支架

BMSCs治疗骨质疏松主要通过干细胞移植方式，植入途径主要可分为3种：局部植入(靶组织植入)、全身植入、联合生物相容性支架植入。全身植入主要方式是血管内给药包括动脉给药及静脉给药[35]。越来越多的证据表明，BMSCs的治疗效果不仅和移植细胞的有效数量有关，和植入途径也有很大关系，为了达到最佳的治疗效果，有必要选择合适的植入方式。血管内给药相比于局部植入，被认为是一种微创途径，能够有效避免靶组织的创伤，但干细胞移植入体内后会受到归巢效应的影响，治疗效果不确切，首先是静脉给药，细胞通过静脉输注，随着血液的流动，由于肺是第一个通过的器官，高比例的细胞可能滞留在肺部，其他器官包括肝、脾等也有可能因细胞滞留产生严重的影响循环的微栓子[36-37]。动脉给药通常被认为可以避免细胞滞留在肺部，并且动脉血流动更强劲有力，可以提高细胞归巢比例，然而还是无法避免可能形成微栓子，造成诸如脑栓塞等血管闭塞的风险，这是一个必须考虑的重要安全问题[38-39]。局部植入是针对病变部位，直接将干细胞移植到相应部位，局部疗效满意，但操作较为复杂，不可避免对靶组织造成人为损害。此外，还有肌肉注射、皮下注射及腹腔注射的给药方式，肌肉注射被认为是一种安全简单的移植方式，并且可以提高细胞滞留时间，其发挥治疗效果的机制与BMSCs的旁分泌作用有关[40-41]。此外，联合应用各种生物相容性支架，能进一步促进细胞归巢。这种支架由最初的羟基磷灰石和磷酸三钙为材料发展到包括胶原材料、壳聚糖、海藻酸盐、纤维素等多种新型材料组成，具有更高的生物相容性，这种移植方式能显著提高移植细胞存活率[42-43]。

3.4 联合药物或物理刺激

联合使用一些药物或者物理刺激手段，能起到增强BMSCs治疗效果的作用。甲状旁腺激素类似物PTH(1-34)是唯一一种促进成骨的临床药物，研究发现PTH通过多种细胞因子及(SDF-1)/(CXCR4)轴调控骨骼代谢，影响BMSCs的动员，间歇性小剂量使用PTH(1-34)，起到促进BMSCs的增殖和成骨分化的作用[44-45]。张媛等[46]发现，临床常用的药物骨肽原液，通过上调ALP、Runx2、OCN、OPN等成骨相关基因，促进Runx2、OCN等成骨相关蛋白的表达，发挥促进BMSCs成骨活性的作用。一些中药提取物、中药含药血清也起到促进BMSCs向成骨细胞分化的效果[47-49]。另外，一些物理刺激手段同样能协同BMSCs的治疗。Zhang等[50]通过采用不同剂量径向冲击波处理体外培养的MSCs，并移植到兔体内观察其对软骨缺损的修复作用，结果表明，冲击波能显著促进MSCs的增殖和自我更新，加速软骨修复过程，显示出良好的临床效果。对靶组织行脉冲式聚焦超声(pFUS)联合静脉注射MSC，能明显促进细胞归巢，这可能由于脉冲聚焦超声作用于靶组织引发上调了调节细胞归巢的局部化学因子，改变了血管通透性，促进MSCs向靶组织迁移[51-52]。

3.5 非细胞治疗

研究表明骨髓间充质干细胞主要通过旁分泌途径，特别是通过分泌营养因子和细胞外小泡(EVs)的方式发挥治疗作用，这种胞外小泡在骨代谢中扮演重要角色。Xie等[53]研究发现，MSCs来源的外泌体能够促进成骨细胞的增殖，下调成骨细胞凋亡相关基因抑制细胞凋亡，改善骨质疏松。Zhao等[54]发现，MSCs来源外泌体主要通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，上调该通路相关蛋白的表达，促进成骨细胞增殖，发挥抗骨质疏松的作用。干细胞来源性胞外小泡作为治疗手段避免了体外培养细胞面临衰老、凋亡，植入细胞引起免疫反应，细胞存活率、归巢率低等缺点，是一种潜在替代细胞治疗的有效、安全、创新性的治疗方法。

4 问题与展望

随着再生医学的发展以及干细胞研究的深入，骨髓间充质干细胞作为一种新的治疗骨质疏松症的策略越来越受到研究者重视。移植BMSCs治疗骨质疏松症虽被证实疗效肯定，前景广阔，但仍有不少挑战，包括对细胞进行修饰具有潜在的突变和致癌风险、移植相关的免疫排斥风险、人类病原体的传播风险等；来源于BMSCs的分泌小泡如何作用于靶组织发挥治疗作用，如何传递细胞因子及对细胞的激活、控制凋亡的途径，相关的作用机制尚有待进一步研究。值得肯定的是BMSCs应用于治疗多种疾病模型，特别是骨疾病方面，已显示出其巨大潜力。相信随着研究的深入以及材料科学的进步，应用骨髓间充质干细胞治疗骨质疏松将不再是挑战。