余明芳 吴晓

1.西南医科大学中西医结合学院·附属中医医院，四川 泸州 640000 2.泸州市中医医院针灸科，四川 泸州 646000

骨代谢是指在骨骼重建过程中发生的分解合成代谢，是破骨细胞吸收旧骨和成骨细胞形成新骨并进一步矿化的动态平衡过程。骨转换标志物(bone turnover markers，BTM)是骨重塑的不同阶段由成骨细胞和破骨细胞产生、释放的蛋白质或基质降解产物，BTM包括骨形成和骨吸收，可动态反映骨代谢情况，在骨代谢疾病的诊断及鉴别诊断、治疗效果评估及预测骨折风险方面有重要意义。

昼夜节律(circadian rhythm)又称近日节律，是指生命活动以近似24 h为一个规律性循环周期的变动。昼夜节律可维持机体的多种生理功能，调节机体应对外界环境变化。研究证实昼夜节律在骨代谢中发挥着重要作用，大部分骨转换标志物都存在昼夜节律性。昼夜节律生物钟调节骨代谢的生理、病理反应，使大部分骨代谢标志物在体液呈现昼夜振荡。生物钟基因是昼夜节律的重要元件，钟基因之间形成的转录翻译反馈环在细胞核内驱动节律性的昼夜转录，对骨代谢中起关键作用的基因和蛋白的表达和活化进行调控。昼夜节律紊乱可破坏骨吸收和骨形成之间的平衡，导致骨骼的内稳态失衡，从而损害骨骼健康，导致骨硬化症、骨质疏松症等疾病的发生并增加骨折风险。前期调查发现，与白班相比夜班人员发生骨折(股骨、手腕或脊柱)的比例增加了近2倍[1]。一项干预性研究将10名健康男性模拟轮班工作，发现其骨形成标志物I型胶原氨基端前肽(procollagen I N-terminal procollagen，P1NP)水平显著降低[2]。由此可见，生物钟与骨代谢关系密切，二者相互交互，相辅相成。

1 骨形成标志物具有昼夜节律性

骨形成相关蛋白主要包括骨钙素(osteocalcin，OC)、骨形态蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、骨膜蛋白(periostin，POSTN)和骨唾液蛋白 (bonesialoprotein，BSP)等。前期研究发现骨形成相关蛋白在机体的表达水平出现日夜波动，且具有一定的节律性。OC是成骨细胞和肥大软骨细胞合成的主要非胶原性羟基磷灰石结合蛋白，它可促进皮质骨的矿化，用来反映成骨细胞的活动[3-4]，研究发现其在多种生物体内均呈现昼夜振荡。人体血尿标本中OC均呈现显著的昼夜节律性，血清OC浓度在午夜达到峰值[5-6]，尿OC水平则上午高，下午低[7]。而在单峰骆驼体内，其峰值和谷值则出现在13:00和18:00[8]。然而，猪的血清OC最高和最低水平却分别出现在18:00和06:00，实验同时发现OC水平在幼年期较高，并且与年龄呈负相关[9]。另外，成骨细胞合成和分泌的OPG是重要的骨形成蛋白之一，它与核因子受体活化因子-κB配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)结合，阻止RANKL与细胞核因子-κB 受体活化因子(RANK)相互作用，从而防止骨骼过度吸收以达到促进骨形成的目的。研究显示机体OPG表达在明相初期较低[10]，并遵循昼夜节律模式呈现日夜变化。另一项分析也表明人体OPG呈现出白天增加，夜间减少的昼夜变化[11]。此外，可诱导成骨细胞分化的BMP在骨形成过程中也发挥着重要作用，也有动物研究发现BMP4 mRNA在骨组织中的表达在ZT8时达到顶峰，振荡周期为24.8 h，呈近日节律[12]。

骨形成相关酶主要包括骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)、组蛋白去甲基化酶(KDM4A)和碱性磷酸酶(ALP)。BALP是属于骨细胞的胞外酶，由成骨细胞合成和分泌，能水解多种磷酸酯，为羟磷灰石的沉积提供必需的磷酸，促进骨形成。动物实验研究显示BALP的峰值出现在下午15:04[13]。此外，骨形成相关肽是骨组织主要蛋白质I型胶原的合成过程中产生的，占骨基质的90%，人体PINP的血液浓度与骨形成的组织形态计量呈正相关[14]，具有明显的昼夜节律性，其浓度呈单峰模式，日间浓度较低，峰值在凌晨3点[5,15]。

由此可见，大部分骨形成标志物如OC、OPG、BMP、BALP和PINP，均具有明显的昼夜节律性，进一步分析显示其峰值浓度大多出现在夜间。

2 骨吸收标志物的日夜振荡变化

骨吸收相关蛋白主要包括成纤维细胞生长因子-23(fibroblast growth factor 23，FGF-23)、RANKL和骨硬化素(sclerotin，SOST)。其中，FGF-23由骨细胞分泌，是调节磷酸盐和维生素D代谢的重要细胞因子，在骨矿化中起着重要作用，与骨小梁微结构受损正相关[16]。研究发现人体FGF-23水平表现出昼夜节律，在早晨达到峰值[17-19]，进一步研究将其峰值时间定位在02:30至11:30[17]。此外，RANKL也是重要的骨吸收蛋白之一，它刺激破骨细胞分化、成熟和活性，从而增加骨吸收。前期动物研究显示RANKL在光照开始时呈现高表达[10]，并遵循昼夜节律模式表达。另外，骨细胞衍生蛋白SOST通过抑制Wnt信号通路减少骨形成，并通过产生RANKL刺激破骨细胞骨吸收来调节骨重建。有研究发现人体SOST具有一定的时间效应，表达出现昼夜波动，其峰值在13:00，谷值在9:00[20]。

骨吸收相关酶如抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatasey，TRACP)主要存在于破骨细胞内，通过结合蛋白酶参与骨代谢过程，是骨吸收和破骨细胞活性的良好标志物。研究表明大鼠TRAP具有特征性的昼夜节律，在明相达到高峰(13:00)，其峰值范围波动在09:00至13:00，谷值范围则出现在21:00至01:00[21]。同样的，牛血液样本TRACP经Cosinor分析也显示有明显的节律，其峰值出现在中午12点[22]。另外，由破骨细胞表达的组织蛋白酶K(CTSK)主要参与编码与骨吸收相关的蛋白酶，它在明相开始时表达最高，提示光照初期骨吸收增加[10]。

此外，骨吸收相关肽如I型胶原C端肽(C-terminal cross-linked telopeptide of type I collagen，CTX-I)也具有昼夜节律变化，研究显示CTX-I是I型胶原分解代谢的产物，其血药浓度与骨吸收的组织形态计量正相关[14]。多项研究证实CTX-I在人体存在昼夜节律性，峰值出现在凌晨5点半左右，谷值在14时左右[17,23-25]。进一步研究证实唾液CTX-I与血清和尿液一样也具有节律振荡[23]，表明CTX-I在机体各个水平均存在日夜变化，受外围生物钟影响。而终末骨基质代谢而来、代表体内同期骨基质的病理性破坏水平的I型胶原交联羧基末端肽(cross-linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen，ICTP)在动物体内的昼夜节律变化有统计学意义，峰值在凌晨03:02[13,26]，而大鼠ICTP则呈现出清晨最高，深夜最低的昼夜节律特点[27]。

此外，骨吸收相关氨基酸也大多具有昼夜节律性。骨基质Ⅰ型胶原纤维的降解产物DPD影响着破骨细胞活动，不同机体内的DPD均存在昼夜节律变化，人体呈现出下午平均血清DPD浓度比上午低，动物在18时最低[28-30]。个体DPD活性达到峰值的时间目前存在争议[31]，研究发现人体内DPD mRNA的表达峰相在凌晨5点[32]。其外周血单核细胞(PBMCs)DPD活性则在00:30至02:00达到高峰[33]。而小鼠肝脏DPD表达的平均值则在03:00最低，15:00最高[34]。大鼠PYD也具有昼夜节律性，其峰值出现在下午1点左右[21]。除了血清和尿液，研究发现人口腔黏膜DPD也具有节律性，午夜升高，峰值约在01:00左右[35]。还有研究发现骨吸收相关基因如c-Fos也存在节律变化，在动物骨骼中有节律性的表达，在黑暗期中期，也就是小鼠的活跃期表达最高[36]。

综上所述，大多数骨破坏标志物如FGF-23、RANKL、SOST、TRACP、CTX-I、ICTP、DPD等均具有昼夜节律性，其峰值时相大多出现在夜间，与骨形成标志物类似，且较骨形成标志物的昼夜节律更加稳定，大都具有明确的峰值和谷值时间。

3 昼夜节律与骨代谢双向交互

3.1 紊乱的昼夜节律变化打破了骨代谢的动态平衡

昼夜节律紊乱会抑制骨形成，加速骨吸收，破坏骨代谢的动态平衡。病理状态下，昼夜节律紊乱可引起多种骨形成标志物表达下调，抑制成骨细胞活性，减少骨形成。有研究评价了昼夜节律改变的小鼠的骨代谢水平，发现其P1NP的血浆水平降低，表明成骨细胞产生的骨基质减少[10]。这与迄今为止在人类中进行的唯一一项干预性研究是一致的，该研究显示，由于睡眠限制和昼夜节律紊乱，P1NP下调[2]。另外，BMP2有显著促成骨作用，实验证实Bmal1显著增加了BMP2的表达，从而增加成骨分化；在MC3T3-E1细胞中敲除Bmal1基因后BMP2表达下调[37]。昼夜节律紊乱会诱导钟基因表达异常，并进一步促使多种细胞因子异常激活破骨细胞的分化并增强其功能，加速骨吸收。一项研究[38]在72 d内反复限制大鼠睡眠，发现其破骨细胞活性标志物TRACP显著增加。骨吸收加速时钟基因(Rev-erbα、Bmal1、per1、per2、Cry1、Clock)以及参与破骨细胞增殖和功能的基因(RANKL、OPG、CTSK)和骨细胞功能(c-Fos)在骨中的表达模式。每周交替的明暗循环扰乱了骨中节律性时钟基因的表达，并导致P1NP和TRAP水平下降，提示骨转换减少。这些效应与15周的明暗循环后骨小梁结构改变和皮质矿化增加相一致，这可能会长期内对骨强度产生负面影响。总而言之，这些结果表明生理正常的昼夜节律对维持骨骼健康非常重要，并强调了进一步研究轮班工作和骨骼疾病之间的联系的重要性[10]。成骨细胞敲除Bmal1后，RANKL的表达明显上调，而Bmal1/Clock过表达则相反地抑制了成骨细胞中RANKL的表达，这些结果提示，成骨细胞时钟系统通过调控成骨细胞RANKL表达，在一定程度上调控骨吸收和骨量[39]。活化T细胞核因子(NFAT)作为OPG-RANK-RANKL系统下游的信号分子，对破骨细胞的分化发挥着重要的转录调节作用，分化后的破骨细胞可实现骨吸收从而导致骨密度降低。CTSK是破骨细胞活性增强的标志。研究表明敲除Bmal1会下调NFATC2的水平的表达[40]，而Bmal1的表达上调则会增强CTSK和NFATc1的表达[41]。另外，轮班工人血清FGF-23水平显著高于传统日班工人[42]。有研究发现结肠癌细胞中PER1转录降低、DPD mRNA表达随之下调，显示DPD mRNA与PER1 mRNA表达呈正相关，提示DPD转录受内源性细胞时钟控制[43]。由此可见，生物钟分子机制被扰乱，会导致骨代谢标志物分泌异常，干扰成骨细胞和破骨细胞功能，打破骨代谢动态平衡。

3.2 骨代谢异常扰乱机体正常的昼夜节律

骨代谢异常使核心钟基因正常表达节律也被扰乱，从而导致生物钟昼夜节律紊乱。通过研究时钟基因与垂体前叶细胞中BMP4的相互作用，证实BMP4可以抑制PER2的表达[44]。研究发现骨性下颌骨发育不全患者体内Bmal1的表达下调，Bmal1敲除小鼠OPG表达减少，体外外源补充OPG显著逆转了由Bmal1敲低引起的破骨细胞分化增强，通过腹膜内注射OPG可部分逆转Bmal1基因敲除引起的骨质流失[45]。肿瘤骨转移可能会导致骨代谢标志物昼夜振幅降低，甚至失去昼夜变化。一项研究发现，绝经后乳腺癌骨转移妇女和健康对照组相比，OC只在健康对照组有明显的昼夜节律[46]。晚期胃肠癌患者的DPD mRNA表达没有表现出昼夜节律[32]。可见异常的骨代谢也在分子和基因水平影响着生物钟的变化。

综上所述，多种生物体内骨代谢标志物大都具有昼夜节律性，且大都呈现夜晚高峰而日间低谷的节律性，表明无论是骨形成还是骨吸收，多在夜间进行。但是由于各种变异因素使研究者对单个骨转换标志物的昼夜节律性得出不同甚至矛盾的结论，其变异的来源是多方面的，包括饮食因素、技术因素、年龄、性别、疾病、生活方式及环境因素。骨代谢与昼夜节律之间具有双向交互作用，异常的骨代谢可扰乱昼夜节律，导致钟基因的表达异常，其中Bmal1的变化最为明显，表明Bmal1基因多方面参与了骨代谢的病理功能；紊乱的昼夜节律又进一步抑制骨形成、加速骨吸收，形成恶性循环。目前来说，对骨代谢昼夜节律的研究仍然存在一些不足，如缺乏单个钟基因与单个骨代谢标志物因子的相关性的研究，缺乏对多种疾病状态下的骨代谢标志物节律变化的研究，缺乏昼夜节律紊乱对骨健康的影响在男性和女性之间的研究。由于数据缺乏，大多数骨代谢标志物只能作为队列研究的筛查工具，无法独立于骨密度作为诊断或预后工具，预测骨折风险，在临床实践中尚未被广泛采用。未来可能需要更严谨的实验设计以及大样本多中心多种生物多种样本的实验，并综合考虑各项指标的敏感性、特异性、检测方法、变异性、影响因素和合并疾病等。此外，骨代谢标志物昼夜节律形成的机制及其与钟基因之间的生理、病理联系是未来的研究重点，可为时间药物治疗提供有力的循证医学证据。