张炎华，何文祥，朱 颖，陈 炜，吴冰珊，修文琼，陈宏彬，俞婷婷，鄢育青，吴晶晶，袁 平，张小鸿，骆 婧，翁育伟，郑奎城

新型冠状病毒(2019-nCoV)属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多型性，直径60～140 nm。该病毒的传播力可能要高于SARS冠状病毒，不同研究团队计算得到的基本再生指数(R0)有不同，大致在2～4之间[1-2]。病毒通过其表面的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合[3]而发生吸附、穿入、脱壳、生物合成与组装、成熟与释放等一系列增殖过程。2019-nCoV的体外培养可在Vero-E6、Huh7及人呼吸道上皮细胞进行。为更好地了解2019-nCoV体外增殖情况，本研究利用一步增殖实验分析病毒在Vero-E6细胞中的增殖特征，并对比了不同实验方法下半数组织培养感染剂量(TCID50)的差异，以期为后续的研究提供一定的基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1材料来源 2019-nCoV病毒株(hCoV-19/Fujian/13/2020)由福建省疾病预防控制中心分离获得并经全基因组测序(序列号：GISAID No. EPI-ISL-411066)[4]，毒株经Vero-E6传代2代，毒株于接种后第6 d收获，-80℃保存。病毒分离及TCID50测定等均在BSL-3实验室内进行。

1.1.2试剂及仪器 Vero-E6细胞(ATCC○RCRL-1586TM)、细胞培养基Minimum Essential Medium(Gibco，Ref. No.41500-034)、胎牛血清(PANSera ES，Cat. No.2602-P130707)、核酸提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Cat. No.52906)、荧光PCR反应体系为AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit(Life Technologies，Cat. No.AM1005)以及中国疾控中心推荐的引物和探针[5]；仪器设备包括二氧化碳培养箱(Innova○Rnco-170)、细胞计数仪(Life，Countess Ⅱ FL)、倒置显微镜(Nikon ECLIPSE TS100)、荧光PCR仪(ABI QuantStudioTMDx)等。

1.2 方 法

1.2.1病毒半数感染剂量(TCID50)的测定 将接种后第6 d(细胞已完全病变)的病毒培养液冻融1次后，离心取上清并分装冻存。取1管冻存的病毒液按半对数稀释法自10-2稀释至10-7，96孔板中长满单层的Vero-E6贴壁细胞用细胞维持液……