曹 蓝，夏 丹，刘艳慧，曾 庆，陈艺韵，陆剑云，李魁彪，张周斌，狄 飚

禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒，根据病毒表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，分为不同亚型：H1～H16；N1～N9[1]，2011—2016年我国家禽禽流感病毒监测显示，近年我国H6亚型禽流感病毒的流行呈上升趋势[2]，同时该亚型也是我国南方地区家禽常见的禽流感病毒亚型之一[3]。研究显示，我国早期H6亚型禽流感病毒主要为H6N1和H6N2[4]，近期主要流行亚型为H6N2和H6N6[5]。前期监测发现，近年来广州地区H6亚型禽流感病毒虽为禽源本地化病毒，但HA基因已出现较大变异，同源性在81.0%～99.1%之间[6]，其中大部分毒株分布在ST2853-like分支，仅有1株病毒分布在ST339-like分支。因此，本研究选取ST339-like分支的A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)病毒进行全基因组序列分析，对全面掌握广州地区H6亚型禽流感病毒的流行和变异情况有着重要的公共卫生意义。

1 材料与方法

1.1毒株来源 A/EN/Guanghzou/13565/2018(H6N2)毒株于2018年分离自广州活禽市场外环境，通过鸡胚接种进行病毒的分离和纯化，通过荧光定量RT-PCR方法对禽流感病毒各亚型进行核酸检测，鉴定为H6N2亚型禽流感病毒，将鸡胚尿囊液分装于-80 ℃冰箱长期保存。

1.2基因测序 参考NCBI数据库中H6N2亚型禽流感病毒HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M、NS全基因组序列，应用Oligo 6软件设计各基因片段全长扩增引物(表1)，引物由广州天一辉远生物公司合成。通过反转录和RT-PCR扩增，经毛细管电泳对基因片段大小进行鉴定后，将阳性扩增产物送至广州天一辉远生物公司，利用ABI 3730测序仪对毒株基因组进行一代(毛细管)测序。

1.3遗传进化分析 应用DNA Star7.1软件拼接各基因序列。……