杨旭辉，陈柳青，吴远菲

（广东省妇幼保健院生殖健康与不孕症科，广东广州 510160）

男性不育约占不孕不育人群的50%左右，其中弱精子症在男性不育中约占19%。弱精子症是指前向运动精子比例低于实验室参考值（a+b<50%或a<25%），其他参数正常的病症。精子活力是评估男性生育的一个重要指标。人精子活力主要来自能量物质氧化，其中线粒体作为精子中最重要的产能细胞器，主要通过能量物质的氧化磷酸化产生ATP为精子生命活动提供能量。完整的人线粒体DNA（mtDNA）是16 569 bp的双链闭合环状分子，编码13条与细胞氧化磷酸化相关的多肽链，22种tRNA和2种rRNA。这13种蛋白质都是呼吸链酶复合物的亚单位，参与细胞的氧化磷酸化和ATP的产生。因此mtDNA对维持精子的正常活力具有至关重要的作用。线粒体基因组只有外显子，而且缺乏抗氧化系统的保护，呼吸链在电子传递过程中容易溢出活性氧，最终损害毫无保护机制的线粒体DNA，任何位点的突变或缺失或替代等改变都会影响线粒体氧化磷酸化过程，进而可能影响精子活力，为了更深入了解精子活力下降的发病机制，许多研究开始关注线粒体DNA的改变，本文对此进行综述。

1 精子线粒体DNA序列缺失

线粒体DNA4977-bp缺失：精子线粒体DNA是独立于染色体的16 569 bp闭环双链DNA，线粒体不仅是细胞内氧化磷酸化、形成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，为细胞生命活动提供能量;还是细胞内产生活性氧(ROS)的重要部位。mtDNA分子近乎裸链，既没有组蛋白等保护又缺乏抗氧化机制，容易受到氧自由基攻击而产生断裂、缺失、突变等改变，进而影响了精子功能。1995年，Kao等[1]通过PCR检测不育男性精子筛查4977 bp缺失，在弱精症、少精症和其他不育男性中发生率确实高于正常人群。1998年Kao等[2]进一步利用密度梯度离心分离获得两种活力截然不同的精子，从活力差的精子群中还检测出mtDNA7345 bp和7599 bp的多发缺失，缺失率远远高于活力好的精子群。2017年Bahrehmand等[3]进一步利用GAP-PCR大规模筛查mtDNA缺失(256例弱精子症患者和200例正常人精子)，观察到弱精子症4977 bp缺失率高达85.93%，而对照组仅14%，提示4977 bp缺失与弱精子症相关性很强。Ambulkar等[4]在70例弱精子症患者中检出6名（6/70；8.57%）7436 bp的缺失，对照组未发现该缺失。40%的percoll组不运动精子数量多于80%的percoll组。40%percoll组分的非运动精子mtDNA 7436缺失率（7.2%）高于80%percoll组分的运动精子（2.7%）。提示精子中线粒体DNA的7436 bp缺失可能是导致精子功能障碍和不活动的重要原因之一。mtDNA 4977 bp缺失和其他类型mtDNA缺失将减少mtDNA编码的蛋白质的合成，这些蛋白质对线粒体的呼吸功能是必要的，所以引起精子活力和生育力降低。Thangaraj等[5]发现，mtDNA编码COXⅡ(细胞色素C氧化酶Ⅱ)的基因在弱精子症患者中存在8195和8196缺失，并在8216位点产生一个终止密码子（AGA），导致截短的蛋白高表达，能量供给不足，提示COXⅡ基因的缺失与精子活力低下相关。Mughal等[6]检测36例弱精症、20例少精症、88例少弱畸形精子症和44例正常样本脱氧核糖核酸细胞色素C氧化酶Ⅲ亚单位15bp缺失率，观察到弱精子症患者中12例缺失(33.33%)，24例杂合(66.66%)，对照组野生型4例（9.09%），缺失13例（29.55%）和27例杂合（61.36%），在少弱畸精症中，野生型2例（2.27%），41例缺失（46.59%）和45例杂合（51.14%）,认为COXⅢ(细胞色素c氧化酶Ⅲ)15 bp缺失与男性不育有显著相关性。MTCYB是呼吸链复合体Ⅲ的亚基，主要催化电子转运至细胞色素C，将质子从线粒体内膜转运至膜外，对线粒体氧化磷酸化起至关重要的作用，而MTATP6参与精子氧化磷酸化过程ATP生成。冯春琼等[7]在80例成年男性弱精子症mtDNA中检测出16例MTCYB片段缺失（20%），4例MTATP6基因片段缺失（5%）。同时MTATP6基因出现G8887A的点突变，突变率为20%，20例活力正常者的样本中未检测到明显的点突变和缺失。以往的研究还发现MTATP6中T8821C、A8784G、C8829T突变，导致精子发育不良，直接影响精子活力。

2 线粒体DNA突变

线粒体DNA由于缺乏组氨酸和损伤修复系统的保护，又是活性氧产生的最重要细胞器，更易受到氧化损伤和其他有害因子攻击导致突变，其DNA发生突变的频率远高于核DNA。

线粒体ND3、ND4L基因表达的多肽链是组成线粒体呼吸链和NADH脱氢酶的2个亚单位，这2个基因发生核苷酸变异的频率比较高。李传连等[8]在50例弱精子症组和42例对照组中共检测出线粒体DNAND3,ND4L基因核苷酸22个变异位点,其中G10320A、A10398G、T10609C为错义突变。A10398G和C10400T核苷酸变异率在弱精子症组显著低于对照组,G10310A核苷酸变异率在弱精子症组显著高于对照组，推测线粒体DNA10398G-10400T多态性可能促进精子活力,线粒体DNAG10310A突变损害精子活力。Spiropoulos等[9]通过不同活力精子mtD‐NAA3243G突变分析，发现A3243G的高突变率与精子活力低下有关。Selvi等[10]也发现，弱精子症患者mtDNAND4基因存在由异亮氨酸取代苏氨酸的错义突变（C11994 T）。Holyoake等[11]则证实正常人线粒体ATPase6基因9055位点和ND4基因11719位点单核苷酸置换率分别为1.3%和0，而弱精子症患者的发生率为10.7%和12%，两者间有显著性差异。上述结果提示，mtDNA突变可能是精子活力降低的主要原因之一。NI等[12]观察到97名弱精子症患者和80名正常男性mtDNA中mt-nd4基因分别有64个和54个核苷酸替换，突变率无差异（66.0%对67.5%，P>0.05）。但有一个突变（G.11084A>G，P.T109A），导致高度保守区的氨基酸被取代，并预测其可能有害。对于mt-tl1，在弱精子症患者中检出一个新的突变（g.3263c>t），在正常对照组中没有。结果表明，mt-nd4和mt-tl1基因可能与中国男性不育有关。Baklouti-Gargouri等[13]筛选了突尼斯人群中患有弱精子症的不育男性(n=34)的体细胞线粒体COX I(细胞色素氧化酶I)基因，并与正常可育男性(n=100)进行了比较。在5例弱精子症患者(14%)中发现了一种新的同源错义线粒体突变(m.6375A>G)，但在正常生育男性中未发现。这种突变将158位的异亮氨酸替换为高度保守氨基酸中的缬氨酸，可导致蛋白质三维结构数(从50降低到26)的降低。Baklouti-Gar‐gouri等[14]检测31例弱精症患者和100例正常人精子线粒体COXI发现6例弱精症患者存在m.6307A>G突变，在正常人群中未检测到。m.6307a>g突变将高度保守区135位天冬酰胺替换为丝氨酸，这种突变可能会削弱精子活力。Baklouti-Gargouri等[15]在31例弱精症患者线粒体COXⅢ基因检测到一个新的突变点m.9588G>A，所有弱精症患者都携带这个突变，m.9588g>a突变将高度保守区128位的谷氨酸替代为赖氨酸。这个突变可能影响线粒体中从还原细胞色素C到分子氧的电子转移，进而影响精子活力。Baklouti-Gargouri等[16]从34例弱精症患者中发现3例存在COXⅢ基因上一个新的错义线粒体突变点m.9387 G>A，正常人群不存在，这一突变将高度保守区61位的缬氨酸替换为蛋氨酸，可能参与精子活力的发生过程。Shamsi等[17]回顾性分析49例弱精子症患者的mtDNA突变和缺失，显示缺失和突变位点通常发生在atpase 6、atpase 8和coii基因。在23例弱精子症患者中22个发生核苷酸替换，9个发生在atpase 6基因，6个在atpase 8基因，7个在coii基因。在22个核苷酸突变中，5个是错义突变，17个是沉默突变。该研究对另外23名少弱精子症患者mtDNA分析当中检测到基于OXPHOS通路的mt突变，其中20名患者存在核苷酸8860处a>g的转换，12名患者存在核苷酸8701处a>g的转换。提示线粒体基因组突变与精子运动能力受损等精液参数差有关。楼哲丰等[18]在弱精子症患者中筛查tRNAHis、tRNASer（AGY）、tRNALeu（CUN）基因突变，132例弱精子症患者中19例标本检出9个突变位点,其中tRNAHis基因突变位点2个,tRNASer（AGY）基因3个,tRNALeu（CUN）基因4个。tRNAS‐er（AGY）基因突变在弱精子症组的发生频率（7.58%）高于 正 常 对 照 组（1.02%）,其 中tRNASer（AGY）基 因m.12234A>G突变6例,正常对照组中未检出，tRNAS‐er（AGY）基因m.12234A>G突变可能是弱精子症发生的相关因素。Siwar等[19]在正常不育男性中发现缺失的COXⅡ基因（m.8021g/a）。这种突变将146位的异亮氨酸替换为蛋白质跨膜功能域中保守氨基酸中的缬氨酸。在tRNA（His）基因中检测到第2个突变（m.12187C>A），在正常人中不存在。它在整个进化过程中是保守的，并影响线粒体tRNA（His）54密码子处T-环区域。

3 蛋白质和核酸分子表达量异常

完整的人线粒体DNA（mtDNA）是双链闭合环状分子，编码13条与细胞氧化磷酸化相关的多肽链，22种tRNA和2种rRNA。这13种蛋白质都是呼吸链酶复合物的亚单位，参与细胞的氧化磷酸化和ATP的产生，在维持精子活力方面发挥重要作用。有研究[20]证实弱精子症患者线粒体COXI和Ⅱ表达明显降低,凋亡率显著增加,线粒体膜电位显著降低,这是精子活力下降的重要原因。另外有研究[21]检测4种线粒体相关mirna（miR-4485-3p/4484/4461和4463）在弱精子症样本中的表达，发现与对照组相比，弱精子症组（AZS）miR-4485-3p显著下调，生物信息学分析确定了miR-4485-3p（DNAH1、KIT和PARK7）与男性不育相关的3个靶基因。miR-4485-3p的下调与特发性AZS有关。Wang等[22]分别检测正常精子和弱精子症供体精子解偶联蛋白2（UCP2）蛋白、线粒体活性氧（mROS）水平和精子线粒体膜电位（MMP）活性，证实UCP2弱精子症组表达明显下降。进一步用Genipin抑制UCP2表达，不仅导致精子活动性受损，而且导致mROS水平升高，提示UCP2-mROS的运动调节系统存在于人类精子的运动中。UCP2通过促进mROS的消除来调控精子运动。

有丝分裂融合蛋白2（MFN2）是一种线粒体膜蛋白，Fang等[23]发现弱精子症组MFN2表达明显低于正常组，此外，抗冻组（冷冻存活率>40%）中MFN2的表达水平显著高于冷冻不耐受组，证实MFN2的表达水平与人类精子的运动和低温保护电位有关。MFN2可能是弱精子症机制研究的新靶点。Prohibitin（PHB）也是一种主要的线粒体膜蛋白，Chai等[24]发现弱精子症（A)和少弱精子症（OA）患者的精子mROS和脂质过氧化水平显著高于正常人，而MMP和PHB的表达显著低于正常人。mROS与脂质过氧化呈正相关，与PHB表达、高MMP、精子活力呈负相关。提示mROS水平升高并与PHB表达降低相关，它可能通过增加低MMP和脂质过氧化来调节精子的运动。PARK7（DJ1）是一种多功能氧化应激反应蛋白，可保护细胞免受活性氧（ROS）和线粒体损伤。Sun等[25]在研究中发现PARK7的下调导致弱精子症患者精子中脂质过氧化物和ROS水平升高，线粒体膜电位降低，线粒体复合物I酶活性降低。提示PARK7缺乏可能增加精子的氧化应激损伤。为以PARK7为靶点的治疗弱精子症开辟了新的途径。线粒体乌头酸酶（ACO2）是一种重要的三羧酸循环调节酶，与正常可育男性相比，弱精子症精子样本中的ACO2蛋白水平显著降低[26]。弱精子症不育男性琥珀酸脱氢酶表达[27]与正常对照染色强度集中在精子中段相比，弱精子症患者SDH在精子头部和中段区域呈弥散分布。SDH的分散表达表明，代谢或遗传因素导致线粒体损伤，影响能量产生，导致精子运动紊乱，具有病理意义。Zhou等[28]发现与健康对照组相比，重度弱精子症患者的sp-miR-151a-5p显著升高。miR-151a-5p-mimics的转染降低了线粒体呼吸活性和三磷酸腺苷（ATP）水平。当miR-151a-5p过度表达时，细胞色素b（Cytb）mRNA和蛋白水平也降低。提示miR-151a-5p通过靶向弱精子症中的CYTB减少细胞ATP的产生。

4 mtDNA容量

mtDNA容量是mtDNA拷贝数，是反映线粒体DNA数量的指标。哺乳动物体细胞mtDNA拷贝数为大约103～104，而成熟精子mtDNA拷贝数仅50～75个，提示精子发生过程中存在mtDNA拷贝数成倍下降的趋势。各国的研究者发现精子mtDNA拷贝数和精子活力及男性不育呈现出显著的负相关性。mtDNA拷贝数在不同活力精子间具有差异，活力越好，mtDNA拷贝数反而越低，活力越差，其拷贝数反而增高。精子mtDNA拷贝数可以作为精子活力是否正常的一个重要参数，高建芳等[29]对161例成年男性精子质量及mtDNA拷贝数的检测及相关性分析，结果发现mtDNA拷贝数与精液质量显著负相关，质量越差的精子拷贝数越高。May-Panloup等[30]分析密度梯度离心后不同离心层精子的mtDNA拷贝数，用实时定量PCR法测定mtDNA/β-珠蛋白基因的比值发现，从100%密度层采集的精子平均mtDNA/β-珠蛋白比率为1.4（正常精子），6.1（出现至少1个异常标准的精子样本），9.1（出现其中2个或多个异常标准的精子样本）。从40%密度梯度层收集的精子平均mtDNA/β-珠蛋白比率为17.1，40%梯度液层含大量不活动精子，提示从异常精子样本中采集的精子中，mtDNA拷贝数有明显增加。Chen等[31]研究证实，与正常人相比，弱精子症和少弱精子症患者有显著更低的精浆游离mtDNA拷贝数，精浆游离mtDNA拷贝数与精子浓度、运动、形态和运动特征呈正相关，与活性氧水平呈负相关。提示精浆游离mtDNA拷贝数与精液参数有关，可作为另一个精液质量的新诊断指标。

5 mtDNA单体

Ruiz-Pesini等[32]研究证实，弱精子症患者精子mtDNA单体分布中T单体明显增多，认为mtDNA单体分布异常与精子活动力低下有相关性。

综上所述，精子mtDNA缺失、突变、各种线粒体相关蛋白质核酸分子含量变化，mtDNA容量改变、单体型等问题均可能引起包括精子活力降低的各种功能异常，我们借助各种诸如realtime-PCR、多重PCR等技术从分子生物学角度探索和阐明弱精症基于线粒体DNA的发病机制，已经取得了一定的进展，为从分子水平研究弱精子症的发病机制奠定了实验基础，为发现具有临床诊断和治疗意义的靶基因对弱精症进行靶向治疗提供了实验依据。