马德亮，秦静，李京烨，赵立臻，李月锋，张翠翠，裴夫来，乔丽，胡凤娟

（临沂市中心医院，山东 临沂 276400）

0 引言

现阶段针对治疗肝癌，常采用手术、消融、栓塞化疗等方式进行治疗，仅对早期肝癌具有一定疗效，无法有效治疗晚期肝癌[1]。采用相应的小分子抑制剂，亦无法获得较为良好的治疗效果[2]。而随着免疫学的发展，免疫治疗技术应运而生，对于治疗晚期肝癌打开了新世界的大门。特异性抗体较传统抗体具有分子量小、渗透性强等特点，且对于肿瘤细胞具有强烈的杀伤效果，能够避免免疫逃逸[3-5]。本文旨在研究放疗联合GPC3 激活性抗体治疗小鼠肝癌的临床效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 试剂

大肠杆菌DH5α 菌株（武汉淼灵生物科技有限公司）、PTT5 载体（上海康朗生物科技有限公司）、Anti-GPC3 人源化抗体（GC33）（北京博尔西科技有限公司）、Anti-CD3 人源化抗体（MT103-CD3）（北京博尔西科技有限公司）、人肝癌细胞（HepG2、Huh7）（上海宾穗生物科技有限公司）、人T 淋巴瘤细胞系（Jurkat）（通派生物科技有限公司）、限制性核酸内切酶（北京恒业中原化工有限公司）、Gibson 装配液（上海淳麦生物科技有限公司）、Taq-DNA 聚合酶（北京索莱宝科技有限公司）、山羊康仁IgG（Fab）2 抗体（北京百奥莱博科技有限公司）、PeproTech 小鼠抗人CD3 SAFIRE（派普泰克生物科技有限公司）、PeproTech 小鼠抗人CD69 FITC（派普泰克生物科技有限公司）、预染蛋白marker（北京百诺威生物科技有限公司）、TEMED（上海延慕实业有限公司）、琼脂糖（北京博尔西科技有限公司）、蛋白胨（济南沃尔德化工有限公司）、酵母粉（江苏奥福生物科技有限公司）、SYBR Green DNA 荧光染料（齐一生物科技有限公司）、微量胶回收即质粒小量提取试剂盒（上海泽叶生物科技有限公司）、质粒大量提取试剂盒（北京万生优达生物技术有限公司）、IL-2（人源）Elisa 检测试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司）、TNF-α（人）ELISA 检测试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司）、TNF-γ（人）ELISA 检测试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司）、封闭液（广东比格莱科技有限公司）、酶稀释液（西宝生物科技股份有限公司）、考马斯亮蓝G250（沈阳晟达化工有限公司）。

1.1.2 仪器及耗材

T3 型PCR 仪（上海赛默科技生物发展有限公司）、TG16-X台式微量高速离心机（长沙湘锐离心机有限公司）、小型高速冷冻离心机（湖南湘通离心机有限公司）、电泳仪（山东科艾瑞生物技术有限公司）、恒温振荡器（杭州瑞诚仪器有限公司）、细胞培养摇床（常州金坛良友仪器有限公司）、电泳槽（辽宁沃欣洁科技有限公司）、超纯水仪（安徽蜀宁仪器有限公司）、全自动酶标洗板机（山东博科生物产业有限公司）、洁净工作台（上海淀山湖净化设备厂）、旋转蒸发仪（济南欧莱博科学仪器有限公司）、酶标计（美国Biotek 公司）、AKTA 蛋白纯化层析系统（美国GE 公司）、CO2 培养箱（上海力新仪器有限公司）、核酸蛋白检测仪（济宁隆成仪器设备有限公司）、12 孔细胞培养板（上海鼓臣生物技术有限公司）、凝胶图像分析仪（北京启航博达科技有限公司）、倒置荧光显微镜（深圳市欧姆微科技有限公司）细胞分析仪（深圳市西尼科光学仪器有限公司）。

1.1.3 实验动物

SCID 小鼠共30 只，均正常发育，周龄为6～8 周。

1.1.4 培养基

RPMI1640 基础细胞培养基、RPMI1640 完全细胞培养基、DMEM 基础细胞培养基及细胞冻存液（均由福州奥研实验器材有限责任公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠肝癌模型[6]

以T、B、NK 细胞免疫缺陷SCID 小鼠建立GPC3 肝癌的小鼠移植瘤模型，其中10 只肝癌细胞浓度达2×106/只，记为放疗组；另取10 只，使其肝癌细胞浓度达2×106/只，记为抗体联合放疗组；其余10 只则作为对照。

1.2.2 构建双特异性抗体[7-10]

将GC33-H 作为模板，并将PTT5-VHF2/GC33-VHR4 作为上下游引物，由此进行PCR，并扩增GC33-VH 片段；同法，将CD3-H 作为模板，并将PTT55-VHF2/GC33-VHR4 作为上下游引物，扩增CD3-VH 片段；胶回收克隆所得片段，并进行核酸电泳；对GC33-VH 及CD3-VH 同时与PTT5-CH 进行真核表达载体，后进行Gibson 连接转化，由此构建PTT5-GC33-H 及PTT5-CD3-H 质粒。

将GC33-H 及GC33-K 作 为 模 板，并 将PTT5-VHF2/ScFv-GC33-R1 及ScFv-GC33-F2/ScFv-GC33-HR2 作 为 上下游引物，由此进行PCR，并扩增回收，得SCFV-GC33-H 及PTT5-CH 片段，后进行Gibson 连接转化，由此构建PTT5-SCFV-GC33-H 质粒；同法克隆得PTT5-SCFV-CD3-H 质粒。

将GC33-H 及GC33-K 作 为 模 板，并 将PTT5-VHF2/ScFv-GC33-R1 及ScFv-GC33-F2/ScFv-GC33-KR2 作 为 上下游引物，由此进行PCR，后以PTT5-CKF/PTT5-CKR2 进行扩增，得轻链恒定区片段CK；回收以上3 个片段，后进行overlap PCR 扩增，得SCFV-GC3-K 片段，并结合PTT5-CL载体进行连接，得PTT5-SCFV-GC33-K 轻链；同法克隆得PTT5-SCFV-CD3-K 质粒。

将GC33-K 作为模板，并将PTT5-VHF2/PTT5-CKR2 作为上下游引物，由此进行克隆，得GC33 抗体的轻链片段；将PTT5-SSCFV-CD3-H 作 为 模 板，以CD3VH-F2/CK-SCFVCD3-R2 作为上下游引物，由此进行克隆，得GC33 单链抗体片段；将以上所得2 个片段进行overlap PCR 扩增，得GC33KSCFV-CD3 片段，后与PTT5-CL 载体连接，得PTT5-GC33KSCFV-CD3 质粒；同法得PTT5-CD3K-SCFV-GC33 质粒；将以上克隆所得片段与载体进行Gibson 装配，由热转化后进入DH5α 菌株，涂板，放置过夜，后选取相应的单克隆进行测序。

1.2.3 转染表达及纯化

将1.2.1 所得4 对质粒分别进行瞬时共转染悬浮CHO 细胞，后将双特异性IgG 抗体进行表达；保留抗体Fc 功能区，在proteinA 与Fc 在碱性条件下结合时，细胞上清液通过介质，以酸将抗体进行洗脱。

1.2.4 特异性抗体治疗

对抗体联合放疗组小鼠行腹腔注射抗体，剂量为4mg/kg，单次最大注射量为200μl。

1.2.5 放射治疗

对放疗组及抗体联合放疗组小鼠肿瘤局部进行单次大剂量的60Coγ 射线照射，设置吸收剂量为20Gy，吸收剂量率为2.73Gy/min，源皮距为10cm。

1.2.6 后处理

以游标卡尺对小鼠肿瘤大小予以测定，以电子天平对小鼠体重予以测定，间隔2d/次；再治疗开始户第10d 每组各处死2 只小鼠，并对其血液、肝脏及肿瘤组织进行相关检测。

1.3 观察标准

1.3.1 血清IL-12、IFN-γ

采用IL-12 试剂盒及IFN-γ 试剂盒，严格参照试剂盒说明书对小鼠的血清IL-12、IFN-γ 水平予以测定。

1.3.2 肝细胞相关物质

测定小鼠的肝细胞IFN-γ 诱生情况，以3H-TdR 释放法对肝细胞的特异性CTL 进行测定。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料应用平均值±标准差（±s），计量资料组间比较采用对照组独立样本t检验，计数资料以百分率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清IL-12、IFN-γ

建立小鼠肝癌模型及注射抗体、放射治疗后，各组小鼠血清IL-12 水平对比，无明显差异（P＞0.05）；注射抗体、放射治疗后，放疗组及抗体联合放疗组小鼠血清IFN-γ 水平均显著高于对照组，但抗体联合放疗组血清IFN-γ 水平显著高于放疗组（P＜0.05），见表1。

表1 小鼠血清IL-12、IFN-γ 水平对比（±s）

表1 小鼠血清IL-12、IFN-γ 水平对比（±s）

注：①为注射抗体、放射治疗后与建立小鼠肝癌模型后对比，P＜0.05；②为与放疗组对比，P＜0.05。

组别 IL-12（*10-12g/mL） IFN-γ（pg）建立小鼠肝癌模型后 注射抗体、放射治疗后 建立小鼠肝癌模型后 注射抗体、放射治疗后放疗组 39.13±1.45 39.98±1.41 103.42±12.71 227.36±86.47 ①抗体联合放疗组 39.25±1.72 40.06±1.11 100.63±13.12 354.63±116.54 ①②对照组 39.18±1.52 40.12±1.34 102.63±12.69 103.16±15.46

2.2 肝细胞相关物质

建立小鼠肝癌模型后，各组小鼠肝细胞特异性CTL 对比，无明显差异（P＞0.05）；注射抗体、放射治疗后，放疗组及抗体联合放疗组小鼠肝细胞特异性CTL 均显著高于对照组，但抗体联合放疗组肝细胞特异性CTL 显著高于放疗组（P＜0.05），见表2。

表2 小鼠肝细胞相关物质水平对比（±s）

表2 小鼠肝细胞相关物质水平对比（±s）

注：①为注射抗体、放射治疗后与建立小鼠肝癌模型后对比，P＜0.05；②为与放疗组对比，P＜0.05。

组别 特异性CTL（%）建立小鼠肝癌模型后 注射抗体、放射治疗后放疗组 0.24±0.07 0.53±0.11 ①抗体联合放疗组 0.25±0.07 0.69±0.23 ①②对照组 0.25±0.08 0.24±0.10

3 讨论

对于癌症的局部改善及机体免疫抑制，通常针对癌症细胞因子基因予以提升，由此达到治疗的效果。如果应用较强的免疫刺激对癌症患者进行质粒，则可能引起免疫逃逸，对患者产生负面影响[11]。对癌症慢性生长进行破坏，并保持免疫系统所处的相持状态，采用激活T 细胞的方式介导抗肿瘤免疫反应最为有效，能够对机体的肿瘤细胞进行杀伤，并营造受侵袭及感染样的环境[12]。故对于肿瘤患者，通常考虑采用直接有效的局部杀伤或结合免疫激活，方能获得更好的疗效。

本次研究结果表明，放疗联合注射GPC3 激活性抗体可有效抑制小鼠肝癌细胞生长，但无法明显观察到肝癌细胞的完全消退，且GPC3 激活性抗体疗效无法从直观数据层面表现其优势，故说明放疗在癌症的治疗中具有较为重要的作用[13]。但GPC3 激活性抗体联合放疗的治疗效果则明显高于单独应用放疗或单独应用GPC3 激活性抗体，联合治疗对于肿瘤具有一定的小腿作用，且小鼠在接收GPC3 激活性抗体后，其再接种肝癌细胞也无法成瘤[14]。小鼠的免疫学结果提升，联合治疗能够诱导其IFN-γ 水平提升，并获得较强的CTL 活性；大致与放疗对于癌细胞的快速杀伤作用相关，进而抑制肿瘤发育生长，降低肿瘤负荷，对其局部的免疫微环境予以改善[15]；不仅如此，放疗亦能够增加其淋巴细胞的浸润，促进IL-2 发挥其免疫调节作用。而应用GPC3 激活性抗体，能够改善荷瘤宿主的免疫抑制状态，对CTL 活性予以增强。且放疗诱导能够促进抗原释放，提升GPC3 激活性抗体介导基因转移的效率。

综上所述，针对小鼠肝癌模型应用放疗联合GPC3 激活性抗体进行治疗，能够获得更为良好的抗癌效果，可进一步探索应用于临床实践中。