罗 舜，章文伟，罗 敏，邓才富，邹艳，杨永东，李品明

(重庆市药物种植研究所，重庆 南川 408435)

中药川贝母(FritillariaecirrhosaeBulbus)为百合科贝母属多年生植物，分别是川贝母FritillariacirrhosaD. Don、暗紫贝母F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia、甘肃贝母F.przewalskiiMaxim.、梭砂贝母F.delavayiFranch.、太白贝母F.taipaiensisP. Y. Li和瓦布贝母F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis(S. Y. Tang et S. C. Yue) Z. D. Liu,S. Wang et S. C. Chen六种[1]。中药川贝母为鳞茎入药，主用于痰热咳嗽、咯痰带血、瘰疬疮疡肿毒[2]。现代药理研究表明其具有镇咳祛痰、平喘、抗癌、抗菌消炎等作用[3]。中药川贝母因其需求量大、生境特殊且种子休眠期长、自然萌发率低、野生资源过度采挖等原因被收载到《国家重点保护野生药材物种名录》中[4-5]。一些地区引种驯化中药川贝母成功率不高，原因在于引种品种与当地生态环境不适宜[6]。因此，开展中药川贝母产地生态适宜性研究来增加药材资源供给就显得十分迫切[7-8]。中药材的基原决定临床用药的真伪[9]，市场上流通的不合格的中药川贝母中往往掺杂有浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母等伪品[10-11]。对不同来源的种植材料、中药材进行鉴定分析就显得十分重要，而分子鉴别技术具有不受外界环境差异和生物体发育阶段及器官组织差异等影响的优点[12]。本文从中药川贝母6种基原植物的传统产区情况、基于地理信息系统(GIS)对其进行产地生态适宜性区划及其DNA分子鉴别技术(PCR-RFLP、DNA条形码技术、实时荧光定量PCR)等方面给以综述，为保证中药川贝母的不同基原品种在生态适宜的区域种植出质优的中药材研究提供参考。

1 中药川贝母的传统产区情况

表1 中药川贝母6种基原植物在全国范围内传统的产区情况Table1 Traditional production areas of six basic plants of F. cirrhosae Bulbus in China

2 中药川贝母产地生态适宜性区划分析技术

2.1 中药材产地适宜性分析地理信息系统及其升

级系统

中国医学科学院药用植物研究所以GIS为分析平台，评价药材道地产区气候、土壤和海拔等生态地理因子与全国其他地区的相似性差异，根据相似程度等级来确定药材的适宜产地，为药材引种成功开发了《中药材产地适宜性分析地理信息系统》(Traditional Chinese medicine geographic information system，TCMGIS-I)[17-18]。王瑀等人[19]应用该系统分析了中药川贝母基原植物之一的暗紫贝母在全国的产地适宜性区划，得到一部分与若尔盖生态气候条件相似的可以发展暗紫贝母生产的新的可能区域。刘辉等人[8]将该系统应用于川贝母的产地适宜性研究，也得到一些未见文献报道的川贝母适宜产区，比如新疆的拜城县、乌鲁木齐市等11个县市。段宝忠等人[20]采用升级系统《中药材产地适宜性分析地理信息系统》(TCMGIS-Ⅱ)分析了太白贝母在全国的产地适宜性区划。结果表明，全国适宜主产区面积大小按省份排名依次为四川、甘肃、陕西，居第四位的云南省为新的适宜区域。张婕等人[21]采用更新为全球的4大数据库(基础地理信息数据库、气候因子数据库、土壤数据库和药用植物分布空间数据库)后的药用植物全球产地生态适宜性分析信息系统(Geographic information system for global medicinal plants，GMPGIS)[22]研究了中药川贝母6种基原植物川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母、太白贝母和瓦布贝母在全球的生态适宜性区划。结果表明，中国和美国所占区域超过全球最适栽培区面积的2/3以上，中国为57%，美国为29%，哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦等我国相邻国家亦有少量最适栽培区域。

2.2 遥感技术

方清茂等人[23]在GIS软件的支持下，从川产道地药材生长生态因子空间数据中提取适宜暗紫贝母生长要求的高程、年平均气温和年降水量，然后将获得的高程、年均温和年降水3图层依次叠加到通过分析遥感影像得到的四川省土地利用现状图中，最后进行空间分析。结果显示，暗紫贝母的最适宜区主要为四川青藏高原东南缘的亚寒带干燥气候区，如阿坝藏族自治州若尔盖、红原、松潘、九寨沟、茂县、黑水、理县、马尔康等地。

2.3 最大墒情模型(Maxent模型)

Maxent模型应用在物种分布数据不全的情况下，可以得到关于物种潜在分布区的满意结果[24]。刘艳梅等人[25]首先用Maxent模型选取对暗紫贝母的分布贡献率较大的主要生态因子，然后将Maxent生成的数据导入GIS系统中，得出暗紫贝母在全国的潜在分布适生区，结果表明四川阿坝藏族羌族自治州、青海省果洛藏族自治州和甘肃省甘南藏族自治州是暗紫贝母最适宜的潜在种植区。王娟娟等人[26]采用GIS结合Maxent模型的方法，对川贝母进行了产地生态适宜性区划，结果得出川贝母在我国的最适宜区面积由大到小依次是四川、西藏、云南、甘肃和贵州等地。赵文龙等人[6]对中药川贝母的4个基原植物川贝母、甘肃贝母、梭砂贝母和暗紫贝母的适宜区也按同样的方法进行了研究。结果表明，川贝母最适宜区主要分布在四川中西部、云南北部及西藏东部；甘肃贝母最适宜区主要分布在甘肃甘南地区与青海交界处、四川西部地区；梭砂贝母最适宜区主要集中在川藏交界处的大部分山区；暗紫贝母最适宜区主要集中在甘肃甘南、四川阿坝和青海果洛的部分地区。蒋舜媛等人[4]按相同的方法对中药川贝母的5个基原植物太白贝母、梭砂贝母、甘肃贝母、川贝母、暗紫贝母进行了适宜性区划，得到中药川贝母的生长适宜性空间分布数据之后，还将其和与中药川贝母化学指标成分总生物碱相关的品质适宜性空间分布数据相关联，最后再结合土地利用等环境因素进行综合分析，形成了对实际生产有指导意义的中药川贝母功能型生产区划。研究结果表明，中药川贝母功能型生产区划主要分布在四川、甘肃、青海、西藏、云南和陕西这6个省的适宜性区县。

3 中药川贝母的DNA分子鉴别技术

3.1 聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性

(PCR-RFLP)技术

PCR-RFLP是一种利用PCR扩增目的DNA片段，再使用特异性内切酶消化扩增产物切割成不同大小片段，最后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测的技术,因仅有正品DNA片段扩增产物被酶切，我们即可依据琼脂糖凝胶电泳图中真伪品表现出的不同特征条带鉴别真伪[27-28]。

《中华人民共和国药典》2010版第一增补本中收录了基于ITS序列的中药川贝母PCR-RFLP鉴别法[28]。张文娟等人[28]用该方法成功鉴别了太白贝母和太白贝母的伪品(伊贝母)，并进一步用基于ITS2的DNA条形码方法验证了PCR-RFLP法的准确性。张文娟等人[10]还将川贝母药材DNA与伊贝母药材DNA按不同比例混合后，应用PCR-RFLP法进行混合样品中伪品的检出限度试验，结果显示伊贝母药材掺入比例低至0.5%时仍可被PCR-RFLP法检出。周亭亭和孙丽媛科研团队[29-30]开发了与PCR-RFLP法鉴定图谱一致的试剂盒法，该方法提取核酸的纯度和浓度更好，他们又用此试剂盒法对全国的70份样品进行真伪鉴定，检测出川贝母伪品33份，正品川贝母37份，体现出良好的检测效果。胡伟等人[31]运用PCR-RFLP法对市售中药川贝母部分样品进行鉴别时，发现PCR扩增阶段还产生了除310 bp的目的条带外小于250 bp的未知条带，接着在NCBI进行BLAST序列同源性比对分析后，确认未知条带是中药材中常见真菌的ITS1条带，将下游引物重新设计在中药川贝母与真菌序列差异较大的ITS2区域，并用改进后的PCR-RFLP方法重新鉴定样品，结果显示出其准确性优于中国药典2015年版中给出的方法。张文娟等人[32]近年运用PCR-RFLP法鉴定暗紫贝母与其伪品时，伪品也在100～250 bp出现2条酶切条带，他们还搜索NCBI数据库进行BLAST鉴定暗紫贝母伪品，未鉴定出其属于哪个贝母植物。

3.2 DNA条形码技术

DNA条形码技术是一种利用公认的、相对较短的DNA片段进行物种鉴别的技术，即在所有正品物种中找到相同的一段DNA片段进行测序，作为标准序列保存在数据库中用来鉴别物种正伪[33-34]。DNA条形码技术主要操作流程包括：提取样品的DNA、引物PCR扩增候选片段、测序并分析序列等[35]。其常用分析方法有最近遗传距离法、BLAST及系统进化关系分析等[36]。2015版《中国药典》收录的DNA 条形码技术指导原则指出植物类药材应以核糖体DNA内转录间隔区ITS2序列为主，叶绿体DNA psbA-trnH序列为辅；而动物类药材以线粒体DNA COⅠ序列为主，ITS2序列为辅[35]。

罗焜等人[37]应用ITS2序列差异实现了5种经常使用的混伪品(伊犁贝母、平贝母、米贝母、一轮贝母、土贝母)与川贝母的鉴别。郑辉等人[38]在PCR-RFLP法鉴别川贝母及其近缘种的基础上，还扩增样品的ITS2和psbA-trnH条形码序列进行了分析，结果表明两种技术均实现了川贝母与其遗传距离较远物种(包括平贝母、浙贝母及伊犁贝母)的鉴别，但都未实现川贝母6种基原植物之间以及它们与其它伪品(包括康定贝母、浓蜜贝母、中华贝母、长腺贝母)之间的鉴别。

3.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光探针或荧光染料，通过伴随整个PCR扩增过程产生的荧光信号累积来对未知模板进行定量分析[39]，实时荧光定量PCR包括TaqMan探针法和SYBR Green I法两种方法[40]。PCR产物长度或组成不同，其熔解曲线(熔解温度)也存在差异，因此可根据熔解曲线的差异进行物种的鉴别[41]。

罗达龙等人[42]采用磁珠法提取中药川贝母中特有DNA片段的同时，按同样的方法对平贝母、浙贝母、土贝母进行处理后，进行SYBR Green I法试验。结果提示，除中药川贝母在PCR时存在拷贝外，平贝母、浙贝母、土贝母无拷贝现象，该结果表明实时荧光定量PCR法可用于中药川贝母及其混伪品的鉴别。潘杰等人[43]将实时荧光定量PCR(探针法)结合溶解曲线的方法应用到中药川贝母与伊贝母的鉴别试验中，分析它们各自的PCR产物形成的熔解曲线时，发现中药川贝母的熔解温度Tm为(71.765±0.625)℃，伊贝母Tm为(64.685±0.055)℃。据此可知中药川贝母与伊贝母的Tm具有特异性，进而就实现了鉴别中药川贝母和伊贝母的目的。陈慕媛等人[44]还用实时荧光定量PCR(SYBR Green I法)结合溶解曲线鉴别中药川贝母与常见伪品平贝母、湖北贝母、新疆贝母、浙贝母,结果提示中药川贝母熔解曲线呈尖锐峰形且Tm为80.98℃，与常见伪品平贝母、湖北贝母、新疆贝母、浙贝母对照药材的熔解曲线温度和峰形有明显差异，据此可知该法也可运用于中药川贝母及其常见伪品的鉴别。

4 结语

该研究基于地理信息系统对中药川贝母的产地生态适宜性区划研究的相关进展进行总结，分别应用TCMGIS系统、GMPGIS系统、遥感技术和最大墒情模型这些现代技术到中药川贝母产地生态适宜性的研究中，得到了适宜推广川贝母种植的新区域，相较于传统靠专家的经验更加高效[21]。蒋舜媛等人[4]在利用最大墒情模型进行川贝母产地生态适宜性研究的同时，还采用地统学的协同克里金空间插值法将川贝母品质与产地关联起来开展研究，这样划分出来新的适宜种植区域更具有科学性。后来的研究者在推广其它中药材品种种植时，可以借用此方法进行深入研究。

PCR-RFLP、DNA条形码技术、实时荧光定量PCR都能成功鉴别川贝母与其常见伪品(如伊贝母、浙贝母、平贝母)。郑辉等人[38]的研究表明，PCR-RFLP、ITS2加psbA-trnH条形码组合技术都未能实现川贝母6种基原植物之间以及它们与其它伪品(康定贝母、浓蜜贝母、中华贝母、长腺贝母)之间的鉴别。

目前，为解决此类近缘种之间无法鉴别的难题，一部分研究者建议应建立以DNA分子鉴定为主，传统的形状鉴定、化学鉴别为辅的鉴定体系[45]，比如，国产黑果枸杞和巴西中草药蒲公英在流通环节都存在使用伪品，顾选等人[46-47]采用类似的研究方法(DNA条形码-产地-形态分析相结合的方法)，成功区分开真伪品。另一些研究者建议把叶绿体的基因组作为超级条形码来鉴别物种[48],叶绿体基因组的大小可达到110～160 kb,较DNA片段具有更多的遗传信息。研究者们借助叶绿体基因组之差异分别实现了豆蔻属物种(32种)、橐吾属物种(6种)和石斛属物种(41种)的鉴别[49]。还有一部分研究者提议从叶绿体基因组中筛选高变异区域[49],李滢等人[50]在贝母属4种植物(川贝母、湖北贝母、太白贝母和瓦布贝母)的叶绿体全基因组中开展了相关研究，结果显示在叶绿体基因区域未筛选到可鉴定贝母属物种的特异性DNA条形码，而筛选到的7个叶绿体基因间区可作为贝母属特异性DNA条形码的候选片段。同时，以上3种方法的快速实现都建立在人们上传更多的生物DNA序列到基因数据库NCBI中。