张清秀,李 镇,李启亮,周 为,甄景慧

(首都医科大学附属北京儿童医院 检验中心，北京100045)

化脓性脑膜炎是儿童常见的中枢神经系统感染疾病,发病率高、病情重，进展迅速，临床上严重威胁患儿的生命，早期诊断和正确的抗感染尤其重要。脑脊液细菌培养和药敏是诊断中枢神经系统感染的金标准，为临床合理使用抗菌药物，改善患儿的症状和预后提供重要依据。为了解北京儿童医院门诊及住院患儿中枢神经系统感染的病情及耐药情况，对2016-2018年脑脊液培养阳性结果进行回顾性分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料2016年1月-2018年12月北京儿童医院门急诊和住院患儿送检脑脊液阳性标本283株(同一患儿多次检测同一菌株按一株计算)，其中95株为门急诊患儿，未使用抗菌药物即行腰穿送检；188株来自住院患儿48小时后送检的脑脊液培养。

1.2 分离培养临床采用无菌技术采集脑脊液2-5 ml,置无菌容器中立即送检。将送检脑脊液分别接种于血平皿和不含万古霉素的巧克力平皿，置35℃二氧化碳孵箱中培养过夜，18-24 h后观察结果。或将脑脊液注入儿童需氧、厌氧、真菌培养瓶，放入美国 Bactec全自动血培养仪中培养，待仪器报警后将标本转种在血平皿、麦康凯平皿、巧克力平皿，孵育后取纯菌进行仪器鉴定。

1.3 仪器鉴定与药敏检验员按照《全国临床检验操作规程》第四版进行严格操作，挑取单个可疑菌落用全自动细菌鉴定仪对细菌进行鉴定。鉴定系统包括BD Phoenix100、Vitek2 Compact、MALDT-TOF质谱仪等。药敏试验主要采用MIC(最小抑菌浓度)法，部分药敏试验采用K-B纸片扩散法，结果判定依据2016版[1]美国临床实验室标准化协会(CLSI)规定进行，耐甲氧西林葡萄球菌根据仪器的头孢西丁筛选试验结果判断；超广谱β-内酰胺酶(ESBL)确证试验：将头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸，头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸贴在涂布待测菌的MH培养基上，35℃孵育18-24 h，任一组药敏抑菌环≥5 mm,即为ESBL阳性。

1.4 统计方法全部数据采用WHONET5.6软件进行统计分析，计数资料采用例表示，率采用百分比显示。

2 结果

2.1 分离科室及年龄分布

2016-2018年自脑脊液标本中共分离出病原菌283株，其中门急诊患儿分离菌95株，占33.6%；住院患儿分离菌188株，占66.4%。住院科室分布如下：感染内科56株，占19.8%；儿童重症监护病房33株，占11.7%；新生儿内科30株，占10.6%；新生儿重症监护病房26株，占9.2%；神经外科26株，占9.2%；血液内科6株，占2.1%；呼吸内科5株，占1.8%；神经内科4株，占1.4%；新生儿外科1株，占0.4%；胸外科1株，占0.4%。

283株分离菌在各个年龄段的分布为：<1个月64株，占22.6%；1个月-12个月120株，占42.4%；1-6岁68株，占24.0%；>6岁31株，占11.0%。

2.2 脑脊液标本分离株的分布

283株分离菌中，革兰阳性菌184株，占65.0%；革兰阴性菌76株，占26.9%；真菌23株，占8.1%。常见革兰阳性分离菌为凝固酶阴性葡萄球菌株(CNS)56株，占19.8%；肺炎链球菌44株，占15.5%；无乳链球菌33株，占11.7%；屎肠球菌17株，占6.0%；金黄色葡萄球菌14株，占4.9%。常见革兰阴性分离菌为大肠埃希菌34株，占12.0%；肺炎克雷伯菌6株，占2.1%；阴沟肠杆菌5株，占1.8%；脑膜炎伊丽莎白菌3株，占1.0%；鲍曼不动杆菌3株，占1.1%；铜绿假单胞菌2株，占0.7%。常见真菌为白色念珠菌9株，占3.2%；新型隐球菌4株，占1.4%。

2016年分离82株，占29.0%；2017年分离94株，占33.2%；2018年分离107株，占37.8%；各年度分离病原菌的分布见表1所示。

2.3 革兰阳性菌药敏及耐药情况

脑脊液阳性标本中，金黄色葡萄球菌对青霉素耐药率92.9%，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)

表1 2016-2018年小儿脑脊液培养阳性常见病原菌的分布 (株)

的检出率为35.7%；凝固酶阴性葡萄球菌对青霉素耐药率80.4%，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的检出率为66.1%；屎肠球菌和肺炎链球菌对青霉素耐药率分别为100%、75%；无乳链球菌对抗菌药物均敏感；未检出万古霉素、利奈唑胺耐药菌株，结果见表2。

2.4 革兰阴性菌药敏及耐药情况

检出产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌20.6%(7/34)、肺炎克雷伯菌83.3%(5/6)；3株肺炎克雷伯菌对碳氢霉烯类耐药、1株阴沟肠杆菌对碳氢霉烯类耐药；铜绿假单胞菌对多数抗菌药耐药率高达50%以上；鲍曼不动杆菌多重耐药严重，除多粘菌素、复方新诺明，均对其余抗菌药耐药率100%；脑膜炎伊丽莎白菌仅对复方新诺明敏感率100%。主要革兰阴性杆菌对常用抗菌药物的耐药率见表3。

3 讨论

通过本次回顾性分析，2016-2018年临床小儿脑脊液标本分离出病原菌283株，并且呈逐年上升趋势，2018年达107株，分离率达37.8%(107/283)。以1-12个月婴儿病原菌分离率最高42.4%(120/283)，6岁以上儿童分离最少11.0%(31/283)，符合化脓性脑膜炎的发病特点：2/3发生于2岁以内小儿，6-12个月是发病高峰年龄。门急诊患儿脑脊液分离病原菌95株，分离率33.6%(95/283)；其中肺炎链球菌检出率最高11.0%(31/283)。国外研究肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌曾被认为是引起获得性细菌性脑膜炎的主要致病菌，但由于流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌疫苗的广泛应用，所致侵袭性感染率显著降低[2]。本次研究，流感嗜血杆菌和脑膜炎奈瑟菌的检出率分别为1.4%(4/283)、0.4%(1/283)，这可能与苛养菌分离技术水平有限，以及分离菌大部分来源于医院感染有关[3]。住院患儿脑脊液分离病原菌188株，分离率66.4%(188/283)，表皮葡萄球菌检出率最高12.0%(34/283)。病房分布多来自感染较重、免疫力低下和年龄较小的科室，其中感染内科检出率最高19.8%(56/283)，其次是重症监护病房11.7%(33/283)，新生儿病房10.6%(30/283)。

表2 主要革兰阳性球菌对常用抗菌药物的耐药情况(株%)

表3 主要革兰阴性菌对常用抗菌药物的耐药情况(株%)

本研究显示，革兰阳性菌检出率65.0%(184/283)，明显高于革兰阴性菌26.9%(76/283)，与CHINT等数据[3-5]接近。排在前五位的细菌依次是CNS、肺炎链球菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、屎肠球菌。有报道，CNS作为皮肤正常菌群，脑脊液中培养出的CNS 80%属于污染[6]。无乳链球菌的分离来自急诊患儿和重症监护病房，多为小于2个月的婴儿。无乳链球菌是一种临床常见的β溶血性链球菌，是发达国家新生儿和婴儿血流感染的常见菌，造成化脓性脑膜炎和败血症病死率较高[7]。革兰阴性菌分离率第一位是大肠埃希菌，分离率12.0%(34/283)，大多是2个月以内的婴儿，这与产妇生殖道内存在大肠埃希菌的污染，因而在阴道分娩过程中，导致新生儿感染大肠埃希菌[8]；另外IgM对大肠埃希菌产生较强的杀伤力，但因胎盘屏障作用，孕妇的IgM并不能大量通过胎盘进入胎儿体内，也导致了新生儿先天就对大肠埃希菌缺乏免疫力[9]。多数报道[3-5]检出第一位是鲍曼不动杆菌，分析原因可能是小儿与成人的区别，成人患者更多接受了侵入性操作和预防性用药，尤其是术后增加了院内感染的机会，本研究分离出3株鲍曼不动杆菌，不作为小儿中枢神经系统感染的主要细菌。

药敏结果显示，CNS和金黄色葡萄球菌对青霉素具有较高的耐药率，MRCNS和MRSA的检出率分别为66.1%、35.7%，MRSA的检出率显著低于CHINT数据分析[3]。屎肠球菌对氨苄西林、青霉素的耐药率分别为94.1%、100%，粪肠球菌只分离一株，均敏感。葡萄球菌和肠球菌均未检出万古霉素和利奈唑胺耐药菌株。药敏结果显示对苯唑西林敏感的菌株，可选用头孢霉素和其他抗菌药治疗。肺炎链球菌对青霉素的耐药率高达75%，目前大量抗菌药的使用，使其多重耐药性日益加重[10]；此外对复方新诺明、头孢吡肟具有较高的耐药性，分别为56.8%、47.7%。在血清型分型中，肺炎链球菌在相对稳定的遗传背景上，容易接受外源基因，导致表型变化[11]。33株无乳链球菌对青霉素、万古霉素、头孢曲松敏感率100%,青霉素和头孢菌素可作为治疗无乳链球菌感染的首选药物，与华春珍[12]等人的研究相同。

作为革兰阴性菌常见的病原菌，大肠埃希菌在脑脊液中检出率占第一位。检出ESBL阳性20.6%(7/34)，对复方新诺明、氨苄西林的耐药率分别是88.2%、44.1%，未发现对碳氢霉烯类耐药菌株。肺炎克雷伯菌药敏表现出高耐药率，检出ESBL阳性83.3%(5/6)，对碳氢霉烯类耐药比例高达50%(3/6)，应引起重视。主要耐药机制是广谱β-内酰胺酶群(ESBLs)的产生，产ESBLs菌株可发生克隆菌株的流行传播，也可通过质粒将产酶基因水平传播给敏感的非产酶菌株，引起更多的细菌产生ESBLs，从而引起院内感染的爆发流行。其他革兰阴性菌分离率较少，阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、脑膜炎伊丽莎白菌对碳氢霉烯类的耐药率分别为20%、100%、50%、100%。鲍曼不动杆菌的多重耐药比较严重，仅对多粘菌素敏感率100%，对复方新诺明敏感率33.3%。3株脑膜炎伊丽莎白菌对复方新诺明均敏感。铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌表现出对氨基糖甙类庆大霉素、阿米卡星均敏感，但其耳毒性、肾毒性副作用较大，阿米卡星可作为儿童用药的添加剂，不能单独使用。近年来，由于头孢曲松、头孢吡肟等第三代、第四代头孢菌素在临床广泛应用，在儿科临床上碳氢霉烯类耐药肠杆菌科细菌(CRE)的增多，给治疗带来困难，最佳治疗方案是应选择≥2种体外有效的抗菌药联合治疗[13]。

此外分离出单核细胞增生李斯特菌9株(无药敏)。脑膜炎奈瑟菌4株，对头孢曲松、美罗培南敏感率100%；对阿奇霉素、环丙沙星、青霉素、复方新诺明耐药率分别为25%、100%、50%、100%。本研究分离出白色念珠菌9株(3.2%)、新型隐球菌4株(1.4%)，药敏结果均未发现耐药菌株。治疗方面，静滴二性霉素B大量时会出现严重的肾功能损害，氟康唑不良反应小，在脑脊液及脑组织中浓度很高，可与二性霉素B联合协同作用，提高治愈率[14]。此外还分离出两例曲霉感染，构巢曲霉和黑曲霉，中枢神经系统曲霉病相对少见，脑脊液分离率低，易感因素包括造血干细胞移植、血液肿瘤化疗、骨髓衰竭综合征、长期大剂量激素治疗等；治疗方面推荐伏立康唑，如不耐受，可选用两性霉素B脂质体。

通过研究得出结论，小儿脑脊液分离培养以革兰阳性细菌为主，革兰阴性细菌、真菌分离较少，为中枢神经系统感染临床的诊断治疗提供依据。1个月-12个月婴儿是细菌性脑膜炎感染的高危人群。脑脊液病原菌培养和药敏显示，对抗菌药物耐药率较高，应引起临床的特别关注，严格无菌操作，控制院感，加强对产ESBLs菌株的耐药性监测。