任光辉 李武雄 齐利豪

胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，病死率、致残率高[1，2]。外泌体（exosomes，exo）是细胞在生理、病理条件下释放到胞外的一种双层膜囊泡，能与靶细胞受体结合或水平转移内含物而发挥生物学功能[3]。研究发现，肿瘤细胞来源的exo 能通过不同机制影响肿瘤的侵袭、转移、血管生成等[4]。本研究探讨胶质瘤干细胞外泌体（glioma stem cells exosomes，GSCs-exo）对体外培养的胶质瘤U87细胞侵袭、迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养U87 胶质瘤细胞株（中国医学科学院基础医学研究所基础学细胞中心提供）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养。

1.2 GSCs 分离、培养及鉴定 取对数生长期U87 细胞，消化重悬后，转移至干细胞培养液（上海索莱宝科技有限公司）培养至第3代细胞，转移至防脱载玻片，贴壁后以多聚甲醛固定，清洗后依次加入Nestin抗体、CD133 一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜，清洗后加入FITC标记的二抗（1∶400；德国默克公司），室温下孵育1 h，避光处理，加入核衬染物DAPI，室温孵育10 min，荧光显微镜下观察。同时在有多聚左旋赖氨酸涂层的载波片上进行第3代GSCs 诱导分化，常规培养5 d后，进行GFAP荧光染色，2周后进行Neun染色，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

1.3 GSCs-exo 的提取与鉴定 超速离心法提取exo。按照QIAAGEN GSCs-exo 提取试剂盒（上海李记生物科技有限公司）说明书，收集GSCs 上清细胞培养液，加入XWP、XE 缓冲液分别离心洗涤、洗脱，获得GSCs-exo 混合液固定，加入3%磷钨酸溶液负染，透射显微镜下观察GSCs-exo形态。RIPA裂解液（上海索莱宝科技有限公司）提取GSCs-exo 蛋白，10%SDS-PAGE电泳分离转移至PVDF膜，室温封闭2 h，加入CD63 一抗（1:500），4 ℃孵育过夜，加入HRP 标记的二抗（1:5 000），孵育2 h，ECL曝光拍照。……