郭文浩，房士琨，张玥，梁照锋

(江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)

胃癌是导致人类死亡的主要恶性肿瘤之一。我国胃癌发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第二位，已成为国民健康的重大威胁。香烟烟雾中含约70种致癌物及大量的自由基和过氧化物，可引起炎症和致癌反应。长期香烟烟雾暴露是许多疾病的主要危险因素，且吸烟的数量和时间与发病率呈正比[1]。研究发现吸烟与胃癌的发生发展存在很强的关联性，但其机制并不清楚[2]。肿瘤干细胞具有干细胞特性，是肿瘤的起源细胞和驱动细胞，与肿瘤的转移、复发及耐药等密切相关，在胃癌等肿瘤的发生发展中具有决定性作用[3-4]。然而目前尚无吸烟与胃癌干细胞相关的研究报道。

近年来植物化学物在肿瘤的防治中颇受关注，其具有抗癌、防癌作用，且安全性高，在肿瘤等慢性病中的防治效应研究已成为重点研究领域之一。然而食源性的植物化学物在肿瘤干细胞的干预方面的研究鲜有报道。大蒜活性成分二烯丙基三硫化物(diallyl trisulfide, DATS)在胃癌、甲状腺癌、肝癌等肿瘤发生发展过程中具有干预效应[5-6]，但其分子机制并不清楚。本研究观察DATS对香烟烟雾悬液(cigarette smoke extract, CSE)增强的SGC-7901源胃癌干细胞干性的干预效应，并探讨其作用机制，为DATS在胃癌防治中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

RPMI-1640培养基、胰酶、胎牛血清、重组人表皮细胞生长因子 (recombinant human epidermal growth factor, rh-EGF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human fibroblast growth factor, rh-FGF)、B27(美国Gibco公司)；PMSF、RIPA(美国Invitrogen公司)，BCA试剂盒(碧云天公司)，PVDF 膜(德国Millipore 公司)，β-连环蛋白(β-catenin)、OCT-4一抗(美国CST公司)，NANOG、LIN28、SOX2、GSK3β一抗(美国SAB公司)，GAPDH(美国Bioworld公司)。电泳仪(美国Bio-Rad 公司)，Ima-geQuant LAS4000mini 化学发光成像仪(日本GE 公司)，倒置式生物显微镜(日本 Nikon公司)，UltraSYBR混合物(康为世纪生物科技有限公司)，实时PCR检测系统(CFX96，美国Bio-Rad公司)。

1.2 细胞系及细胞培养

人胃癌SGC-7901细胞株购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库，培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并置于37 ℃、5% CO2的恒温细胞培养箱。用含20 ng/mL rh-EGF、10 ng/mL rh-FGF、2% B27无血清培养基培养处于对数生长期的SGC-7901细胞7 d。根据细胞球的形成情况及干性基因的表达情况判断干细胞是否培养成功。

1.3 香烟烟雾悬液的制备

本实验所用香烟为国内较为常见的香烟，其烟碱量为1.0 mg，焦油量为10.0 mg。将点燃的香烟用负压驱动装置连续抽吸，香烟烟雾溶于10 mL的RPMI-1640无血清培养基中，摇匀，5 min燃烧完，调节pH值至7.40，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，以此悬液为100%，按实验所需稀释使用，每日新鲜制备。

1.4 筛选适宜的DATS浓度

取对数生长期的SGC-7901源胃癌干细胞制成单细胞悬液，接种于24孔板中，4 000个/孔，用0%、0.25%、0.50%的CSE和5、10、20 μmol/L的DATS单独或联合连续处理7 d，每组设3个平行。溶剂对照用DMSO处理。每天更换含特定生长因子(20 ng/mL rh-EGF、20 ng/mL rh-FGF 和 2% B27)及处理因素的新鲜培养基。7 d后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其细胞活力，筛选适宜的DATS浓度。

1.5 显微镜观察DATS对胃癌干细胞的干细胞球形成的影响

分别用0% CSE、0.25% CSE、0.25% CSE+10 μmol/L DATS、0.50% CSE和0.50% CSE+10 μmol/L DATS连续处理SGC-7901源胃癌干细胞7 d，每组设3个平行。每天更换含新鲜的CSE、10 μmol/L DATS和含特定生长因子(20 ng/mL rh-EGF、10 ng/mL rh-FGF和2% B27)的无血清培养基。7 d后显微镜下观察胃癌干细胞球大小，并拍照和计数。

1.6 蛋白质印迹检测胃癌干细胞基因和Wnt通路相关蛋白

用0%、0.25%和0.50% CSE，10 μmol/L DATS和20 μmol/L 氯化锂(LiCl)单独或联合连续处理SGC-7901细胞来源的胃癌干细胞7 d，按照蛋白提取试剂盒的说明书提取总蛋白，测定蛋白浓度。12%SDS-PAGE分离等量的蛋白质。 将蛋白质电转移到0.22 μm PVDF膜上，在5%脱脂牛奶中封闭1 h，然后与一抗β-catenin、OCT-4、NANOG、LIN28、SOX2、GSK3β (均1 ∶1 000)，GAPDH (1 ∶500)孵育过夜，1×TBST洗3次，羊抗兔二抗孵育1 h，1×TBST洗5次，化学发光分析仪进行检测。

1.7 实时定量PCR检测胃癌干细胞干性基因

收取各个处理组的胃癌干细胞，预冷的PBS洗2次，按照RNA提取试剂盒的说明书提取胃癌干细胞总RNA，并测定RNA浓度。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。使用UltraSYBR混合物在实时PCR检测系统上检测NANOG、OCT-4、SOX2、LIN28、GAPDH的表达水平。PCR反应体系为：Mixture (UltraSYBR) 10 μL，无RNA酶水8 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。 PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，共进行36个循环。引物序列如下，NANOG：上游5′-GGAACGCCTCATCAATGC -3′，下游5′- TGTCAGCCTCAGGACTTGAGA -3′；OCT-4：上游 5′- AC-ACCAATCCCATCCACACT-3′，下游 5′- GCAAACTTCCTGCAAAGCTC-3′；SOX2：上游5′-TTGAGGCTCTGCAGCTTAG-3′，下游 5′-GCCGGTTACAGAACCACAC-3′；LIN28：上游5′-TCGGCTTCCTGTCTATGACC-3′，下游5′-GGAATCCATCCGTGTCACTG-3′；GAPDH：上游 5′-GCTGCCCAACGCACCGAATA-3′，下游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 DATS能抑制CSE促进的胃癌干细胞自我更新能力

MTT实验结果显示，10 μmol/L DATS能显著抑制CSE诱导的细胞增殖，为最适作用浓度(图1)。0.25% CSE和0.50% CSE处理组的悬浮细胞球明显大于0.25% CSE和0.50% CSE与DATS联合处理组，表明DATS能抑制CSE促进的胃癌干细胞球的形成(图2)。

①：0% CSE，②：DMSO，③：0.25% CSE，④：0.25% CSE+5 μmol/L DATS，⑤：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，⑥：0.25% CSE+20 μmol/L DATS，⑦：0.50% CSE，⑧：0.50% CSE+5 μmol/L DATS，⑨：0.50% CSE+10 μmol/L DATS，⑩：0.50% CSE+20 μmol/L DATS。a：P<0.01，与0% CSE相比；b：P<0.01，与0.25% CSE相比；c：P<0.01，与0.50% CSE相比

①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，与0% CSE相比；b：P<0.05，与0.25% CSE相比；c：P<0.05，与0.50% CSE组相比

2.2 DATS能抑制CSE促进的胃癌干细胞干性基因的表达

qRT-PCR结果显示，DATS能明显抑制CSE促进的胃癌干细胞的干性基因NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28的mRNA水平(图3A)。蛋白质印迹结果显示，DATS联合处理能抑制CSE诱导的胃癌干细胞NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28蛋白表达水平的上调(图3B)。

2.3 DATS抑制CSE促进的胃癌干细胞Wnt通路活性

蛋白质印迹结果显示，DATS能抑制CSE导致的β-catenin、GSK3β蛋白表达异常，提示DATS能抑制CSE促进的SGC-7901源胃癌干细胞Wnt通路活性。见图4。

A：qRT-PCR检测胃癌干细胞干性基因的mRNA表达；B：蛋白质印迹检测胃癌干细胞干性基因的蛋白表达。①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，与0% CSE相比；b：P<0.05，与0.25% CSE相比；c：P<0.05，d：P<0.01，与0.50% CSE相比

①：0% CSE，②：0.25% CSE，③：0.25% CSE+10 μmol/L DATS，④：0.50% CSE，⑤：0.50% CSE +10 μmol/L DATS。a：P<0.01，与0% CSE相比；b：P<0.05，与0.25% CSE组相比，c：P<0.01，与0.50% CSE组相比

2.4 DATS调控Wnt通路抑制CSE增强的胃癌干细胞干性

蛋白质印迹结果显示，DATS能显著抑制CSE激活的Wnt通路和胃癌干细胞干性基因NANOG和OCT-4的mRNA和蛋白表达水平。氯化锂和CSE联合能进一步激活Wnt通路，而氯化锂与DATS的联合作用，使GSK3β蛋白表达水平上调，而β-catenin蛋白表达水平下调(图5A)。同时氯化锂能明显上调胃癌干细胞干性基因NANOG和OCT-4的mRNA和蛋白表达水平，氯化锂与DATS的联合作用能部分减弱氯化锂引起的NANOG和OCT-4的表达水平上调(图5B，5C)。初步说明DATS能通过调控Wnt通路抑制CSE增强的胃癌干细胞干性。

A：蛋白质印迹检测Wnt通路活性改变；B：qRT-PCR检测胃癌干细胞干性基因mRNA表达水平；C：蛋白质印迹检测胃癌干细胞干性基因蛋白表达水平。①：0% CSE，②：0.50% CSE，③：0.50% CSE+DATS，④：0.50% CSE+LiCl，⑤：0.50% CSE+DATS+LiCl。a：P<0.01，与0% CSE相比；b: P<0.01，与0.5%CSE相比；c: P<0.05，d： P<0.01，与0.5%CSE+LiCl组相比

3 讨论

肿瘤干细胞是具有干细胞特性的细胞，最初已获得致癌突变，具有自我更新和分化的可能性，从而负责整个肿瘤细胞群的产生及异质性、耐药性和侵袭性，在胃癌等肿瘤的发生发展中具有决定性作用。研究表明，香烟烟雾能够促进肿瘤干细胞的自我更新能力和干性基因的表达，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。Qian等[7]发现，香烟烟雾暴露能增强肾癌干细胞干性基因的表达，进而在肾癌的发展中发挥重要作用。Wang等[8]研究表明长期的香烟暴露会促进人支气管上皮细胞干细胞样特性的获得，促进增殖与侵袭，抑制凋亡。Nimmakayala等[9]在细胞与动物实验中证明，香烟烟雾会诱导胰腺癌细胞中的干细胞功能，从而进一步促进胰腺癌的发展。本研究的结果同样证明了香烟烟雾能促进胃癌干细胞的自我更新能力，并且能增强胃癌干细胞干性基因NANOG、OCT-4、SOX2和LIN28的表达水平，能够增强胃癌干细胞的干性。

DATS是从大蒜、洋葱等植物中提取的一种有机硫化合物，能通过提供硫自由基和巯基而发挥生物学作用，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种功能。研究发现，DATS在多种肿瘤的发生发展过程中具有干预效应。 Tao等[10]研究结果显示DATS对胃癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，并可以诱导其凋亡。Liu等[11]研究结果显示DATS能下调乳腺癌多种转移相关基因的表达，从而抑制乳腺癌的转移。Wnt信号通路在多种生理病理过程发挥作用，近年来发现其在维持肿瘤干细胞干性中具有非常重要作用。本研究结果显示，DATS能够干预香烟烟雾促进的胃癌干细胞的自我更新能力，抑制香烟烟雾促进的胃癌干细胞干性基因OCT-4、SOX2、NANOG和LIN28的表达水平，Wnt信号通路在其中发挥了重要作用。

综上所述，本研究结果初步显示了DATS对香烟烟雾促进的胃癌干细胞干性的干预效应，进一步研究发现DATS可通过调控Wnt信号通路抑制胃癌干细胞的干性。然而，本研究并未在体内实验中探讨DATS干预效应的分子机制，我们将在后续研究中加以探讨，进一步提升DATS在胃癌等肿瘤防治中的价值。