神经纤毛蛋白1和血管内皮生长因子受体2在肝细胞癌组织中的表达和临床意义
2021-03-24胡杰,韩正祥,杜秀平
肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，它是全球 导致癌症死亡的第二大原因。全球每年新增肝癌病例782 500例，死亡745 500例，仅中国就占总病例和死亡人数的50%左右。其中肝细胞癌占原发性肝癌的85%～90%。目前，手术切除和肝移植是唯一可能治愈的策略，但在根治性切除后，尤其是在残余肝中，复发率仍然很高，约80%病人在诊断时已为肿瘤晚期，中位生存期约为8个月，其预后普遍令人沮丧。近年来，人们对其侵袭和转移的分子机制进行了大量的研究，但有关肝细胞癌恶性和转移的详细机制尚不明确，因此，识别肝细胞癌可靠的肿瘤分子生物标记物对于个性化治疗和评估预后至关重要。神经纤毛蛋白1（neuropilin-1，NRP-1）最初被描述为对神经元发育具有重要作用的信号受体，同时很多研究发现，NRP-1在许多癌症的血管生成和恶性进展中起重要作用，如：乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、黑素瘤和胰腺癌等。但它在肝细胞癌方面的相关研究鲜见报道，因此，本研究通过应用免疫组织化学法检测肝细胞癌组织及癌周正常肝组织的NRP-1、血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）表达情况，探讨NRP-l、VEGFR2在肝细胞癌的表达与临床病理特征、预后的关系，为肝细胞癌的诊治、预后评估提供新思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2014年11月至2018年11月徐州医科大学附属医院肝胆外科行手术切除并经病理学确诊为肝细胞癌的石蜡包埋标本共40例，并获得20例癌旁正常肝组织标本，均有完整的临床资料。所有病人术前未接受任何抗肿瘤治疗，且经影像学检查排除远处转移。男性25例，女性15例；中位年龄60岁；有慢性肝炎病毒感染26例，无慢性肝炎病毒感染14例；合并肝硬化26例，未合并肝硬化14例；Child-Pugh分级A级29例、B级11例。病理分级高分化8例，中分化21例，低分化11例；TNM分期Ⅰ期22例，Ⅱ期6例，Ⅲ期12例。对所有病人进行至少为期1年的随访，记录病人术后1年复发情况，末次随访时间为2019年11月。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。1.2 方法
主要试剂包括购自美国的affinity公司的兔抗人NRP-1单克隆抗体，购自美国的proteintech公司的兔抗人VEGFR2单克隆抗体，购自福州迈新生物科技有限公司的兔SP免疫组化检测试剂盒和DAB显色剂。将40例肝细胞癌组织及20例正常肝组织标本蜡块制备成4µm厚连续切片，60℃烤片2 h，行NRP-1和VEGFR2免疫组化染色。1.3 判定标准
显微镜下观察组织细胞中NRP-1和VEGFR2蛋白的表达情况，选取3个高表达区域拍照保存（所有图片均400×拍摄），使用Image-Pro Plus图像分析软件对免疫组化图片进行处理，计算平均光密度（average optical density，AOD）。1.4 统计学方法
采用SPSS Statistics 22.0软件对数据进行统计学分析，使用Shapiro-Wilk（W检验）判断数据是否服从正态分布。NRP-1和VEGFR2在肝细胞癌和癌旁正常肝组织的表达及与各临床病理参数之间的关系采用两独立样本t
检验。NRP-1和VEGFR2的表达的相关性采用Pearson相关分析。NRP-1和VEGFR2的表达高低与病人术后复发关系采用χ
检验。检验水准α
＝0.05。2 结果
2.1 肝细胞癌组织及正常肝组织的NRP
-1、VEGFR2的表达情况
免疫组化结果显示，NRP-1和VEGFR2主要表达在肿瘤细胞和血管内皮细胞的细胞质和细胞膜上（图1）。NRP-1、VEGFR2在肝细胞癌组织中AOD分别为（0.398±0.051）、（0.454±0.058），在正常肝组织中的AOD分别为（0.244±0.095）、（0.337±0.064），经t
检验分析NRP-1、VEGFR2在肝细胞癌组织和正常肝组织中的表达差异有统计学意义（t
=6.815，P
＜0.001；t
=7.155，P
＜0.001）。2.2 NRP
-1、VEGFR2的表达与肝细胞癌临床病理特征的关系
肝细胞癌组织的NRP-1、VEGFR2的表达水平与病人性别、年龄、有无慢性肝炎病毒感染、甲胎蛋白水平、肿瘤数目、有无肝硬化、Child-Pugh分级无明显相关性（均P
＞0.05
）；而与病人肿瘤的最大径、有无血管侵犯、分化程度、TNM分期有关（均P
＜0.05）。见表1。2.3 肝细胞癌组织中NRP
-1与VEGFR2的相关性分析
Pearson相关分析显示，NRP-1和VEGFR2在肝细胞癌组织中的表达存在正相关（r
=0.789，P
＜0.001）。2.4 肝细胞癌组织中NRP
-1、VEGFR2的表达与病人术后复发关系分析
根据NRP-1、VEGFR2各自的算术平均数分为高、低表达组，肝细胞癌组织中NRP-1、VEGFR2低表达组术后1年复发率［5.56%（1/18）、20.00%（4/20）］明显低于NRP-1、VEGFR2高表达组［63.64%（14/22）、55.00%（11/20）］（χ
=14.249，P
＜0.001；χ
=5.227，P
=0.022）。3 讨论
肝细胞癌是一种富血供肿瘤，它的发生、进展与新生肿瘤血管的生成有密切关系。血管生成是肿瘤进展的重要组成部分。新血管的生成为细胞增殖提供氧气和营养，同时去除二氧化碳和代谢废物。不仅支持了恶性肿瘤的快速生长，而且通过提供一条逃逸到身体中远部位的路径，增加肿瘤的转移潜力。血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）是其中一个关键的促血管生成信号分子，它主要通过与VEGFR2的相互作用来促进细胞增殖、迁移、骨架重组、分化和新脉管系统的形成及动员内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）从骨髓进入外周循环。VEGF的过度表达与多种肿瘤的进展和预后不良有关，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌和黑色素瘤。本研究检测了肝细胞癌组织中VEGFR2的表达情况，结果显示与正常肝组织细胞相比，肝细胞癌组织中VEGFR2的表达明显升高，这与在其他恶性肿瘤的表达相符。同时我们进一步分析了VEGFR2的表达与肝细胞癌病人的临床病理特征及复发情况的关系，发现它与肿瘤组织的最大径、有无血管侵犯、分化程度、TNM分期明显相关，VEGFR2高表达的肝细胞癌病人组术后1年复发率明显高于VEGFR2低表达的肝细胞癌病人组，这表明VEGFR2的表达与肿瘤的增殖、侵袭性有关，并可作为临床判断肝细胞癌预后的指标之一。
表1 NRP-1、VEGFR2的表达与40例肝细胞癌病人临床病理参数的关系/±s
NRP-1是I型跨膜糖蛋白，可以促进肿瘤发生的各个方面，如血管生成、细胞存活、迁移、侵袭和化疗耐药。NRP-1参与肿瘤进展的机制，主要与肿瘤血管生成有关，这与其通过表达在肿瘤内皮细胞中的VEGFR2增强VEGF介导的信号传导的相关。NRP-1还被证明介导了依赖血小板衍生生长因子B（platelet derived growth factor B，PDGF-B）的间充质干细胞-周细胞的转变和募集。这两个事件在肿瘤血管重构和转移扩散中起着重要作用。此外，NRP-1能结合几种促血管生成细胞因子，并能放大肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）诱导的促血管生成的刺激信号，而且已经在胶质瘤、胰腺癌和前列腺癌等中得到证实。本研究结果显示NRP-1在肝细胞癌组织中高表达，在正常肝组织中低表达或不表达，这与其他研究相一致，这些结果提示NRP-1表达与正常组织的恶性转化有关。更重要的是，我们还发现它与肿瘤组织的最大径、分化程度、TNM分期明显相关。与NRP-1低表达的病人相比，NRP-1高表达的病人的显示不良的预后，这表明NRP-1可以作为肝细胞癌病人的一种新的预后生物标志物。本研究结果与前期王金爽、杨丽报告的其在NSCLC的作用相类似。
我们还检测了肝细胞癌中NRP-1与VEGFR2的相关性，两者成正相关（r
=0.789，P
＜0.001），而VEGFR2对肿瘤血管生成、促进内皮细胞增殖和增加血管通透性至关重要，因此，NRP-1可能通过促进肝细胞癌中的VEGFR2表达来促进血管生成。有研究发现NRP-1是一种共受体来介导VEGFR2的活性，可增强VEGF与VEGFR2的结合，从而促进内皮细胞中的VEGF介导的下游信号通路。也有研究表明NRP-1不仅促进VEGFR2信号转导、内吞作用、信号输出，还可促进VEGFR2非依赖性的VEGF-A信号转导、整合素介导的纤维连接蛋白组装和基质黏附。本研究进一步地支持了他们的观点。目前，阻断血管生成已成为一种突出的策略，以补充化疗方法来治疗癌症。虽然两项大型国际多中心Ⅲ期临床试验均充分证明了索拉非尼对晚期肝细胞癌有一定的生成获益，但仍不能令人满意。最近，一种人IgG单克隆抗体被开发出来，阻断位于VEGF结合位点的NRP-1 B1B2结构域，值得注意的是，该抗体阻断了血管生成和血管重塑。因此，NRP-1可以作为潜在的血管生成靶点。
总之，本研究结果提示NRP-1、VEGFR2的高表达与肝细胞癌的发生、发展有关，可以作为判断肝细胞癌病人预后的分子标志。同时针对NRP-1的靶向药物正在研制中，NRP-1有望成为一个新的治疗靶点。由于本研究的样本量较少，随访时间较短，无法得出NPR-1、VEGFR2的表达与总生存期的关系，因此需要继续随访病例，并进一步扩大样本量进行验证。
