单相炭材料的生物相容性

2021-03-23周宇于澍李云平

粉末冶金材料科学与工程 2021年1期

周宇，于澍，李云平

(1. 中南大学粉末冶金国家重点实验室，长沙 410083；2. 中南大学轻质高强结构材料重点实验室，长沙 410083)

随着人口老龄化与意外创伤的增加，生物植入材料市场需求量巨大。单相炭材料如树脂炭、炭纤维、热解炭和石墨均具有良好的生物相容性，并且能够促进骨组织再生、耐体液腐蚀等优点。近年来由于这些优点，单相炭材料被组织工程、肿瘤治疗等生物医学领域广泛关注；目前单相炭材料可用于肌腱、韧带、股骨头、心脏瓣膜等临床领域[1-3]。

近年来，有关单相炭材料生物相容性的研究很多。段海英等[4]采用CCK-8 比色法检测炭纤维桩、玻璃纤维桩和石英纤维桩浸出液对细胞活性与增殖的影响，计算出3 种纤维桩材料实验组的相对增殖率(RGR 值)均＞75%，细胞毒性均为1 级，生物相容性良好。刘向荣等[5]将炭纤维敷料与传统凡士林油纱进行临床试验比较，发现炭纤维敷料无细胞毒性、无刺激、无致敏等感染现象，使用炭纤维敷料试验组炎症现象明显减少，更容易促进伤口愈合。PETERSEN[6]将双苯基聚合物/炭纤维复合材料植入到老鼠胫骨喂养14 天后进行观察，发现植入材料上的炭纤维暴露于生物环境中会刺激骨生长，骨细胞生长进入到炭纤维的空隙中，表明炭纤维具有良好的生物相容性。SHAHED[7]等将未制备涂层的氧化钛与热解碳(PyC)涂覆氧化钛的无机纳米颗粒用噻唑蓝法(MTT)进行检测，发现未制备涂层的氧化钛纳米颗粒在颗粒质量/完全培养液浓度为0.01～1 mg/mL 时具有很高的细胞毒性，而热解炭涂覆的氧化钛纳米颗粒在相同的浓度时，具有很好的生物相容性。

单相炭材料的体外细胞毒性试验虽然表现为无毒，但植入体内后，材料受体液的冲刷导致颗粒脱落会影响材料的生物相容性。BOKROS 等[8]研究发现，石墨材料应用于制造炭心脏瓣膜，可以制造出重量小于 1 g 的心脏瓣膜。但SILVIA 等[9]将石墨植入老鼠的皮下组织去评估其生物相容性，却发现石墨引发了机体的排异反应。熊信柏[10]等将带羟基磷灰石涂层和不带涂层的炭/炭复合材料植入到犬的后肢股骨上，术后普通饲料喂养，分别于28 d 和84 d 后取材进行组织观察，发现在28 d 还是84 d 后无论骨组织还是纤维结缔组织内都存在细小的炭颗粒。在28 d 后取出的部分组织内，还发现有巨噬细胞，表明有炎症产生。但84 d后，未观察到巨噬细胞。倪昕晔等[11]把炭/炭复合材料植入到家兔的肌肉组织中，观察植入物周围组织、肌肉、肌腱和滑膜等处，均发现有细小的炭颗粒，且周围有巨噬细胞以及白细胞,说明炭颗粒的存在可引发组织的炎症。

上述研究表明炭材料虽然由于其生物惰性而使其具有良好的生物相容性，但材料在植入生物体后会有材料颗粒的脱落，脱落的炭颗粒会在伤害周围的组织同时引发生炎症，对人体造成损伤，所以研究材料颗粒脱落对生物相容性的影响，探寻其影响机理很有必要。单相炭材料凭借着自身良好的生物相容性以及材料获取简单和低成本，有着广阔的应用前景，然而，尽管前人已做出了相应的探索，但其生物相容性评价尚未完善。实际的临床应用中单相炭材料并不常见。

本研究采用树脂炭、炭纤维、热解炭和石墨4 种单相炭材料为原材料，在模拟体液和恒温水浴摇床中测定材料颗粒脱落量，同时利用MTT 法、直接接触实验观察细胞生长形态，通过细胞超微结构观察研究单相炭材料颗粒对细胞生长的影响，综合评定单相炭材料对细胞生长与增殖的影响，为后期单相炭材料的临床应用奠定理论基础。

1 实验

1.1 材料处理

将树脂炭、炭纤维、热解炭和石墨清洗后放入高压灭菌锅(121 ℃，50 min)中灭菌，然后放入真空干燥机中干燥备用。

1.2 实验方法

1.2.1 材料在模拟体液中颗粒的脱落试验

取相同表面积的4 种炭材料放入塑料烧杯中，加入40 mL 人体模拟体液(simulated body fluids，简称SBF)[12]，同时设置空白实验组(完全培养液)，然后将烧杯放入2 Hz，37 ℃的小型恒温振荡器中震荡，分别在24、72、120 和168 h 过滤SBF 溶液。采用针筒注射器将震荡后的SBF 溶液吸取到孔径为0.22 μm 的微孔滤膜中过滤，将过滤后的滤膜烘干至恒重，采用精度为0.1 mg 电子天平测量滤膜过滤前后的质量，采用下述公式计算材料颗粒的脱落量(μg/cm2)：

材料颗粒脱落量记为m0，滤膜过滤前的质量记为m1，滤膜过滤后的质量记为m2，材料的表面积记为s。

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1.2.2 体外细胞毒性实验

使用(噻唑蓝法，简称MTT 法)，将树脂炭，炭纤维，热解炭，石墨4 种材料经过清洗、灭菌和真空干燥后，配制成浓度为101.09 cm2/mL(材料表面积/完全培养液体积[13])的材料浸提液，随后静置于CO2培养箱中(37 ℃，体积分数为5%的CO2)。材料浸提时间分别为24、72、120 和168 h，收集不同浸提时间的材料浸提液放入无菌干燥的离心管中保存备用。

将L929 细胞接种至25 mL 的培养瓶中，放入CO2培养箱(37 ℃，5%CO2)中培养，待细胞长至培养皿面积的80%时，经PBS(phosphate buffered solution)溶液润洗、胰酶消化并经完全培养液吹打后，得到细胞分布均匀的细胞悬液。随后对细胞进行铺板，将其接种至96 孔板中，并放入CO2培养箱培养24 h，每组均设立3 个复孔。待细胞贴壁良好后弃置孔中原液，向每孔中加入100 μL 材料浸提液，同时设置阳性对照组(0.1%苯酚＋99.9%完全培养液，体积分数)和空白对照组。置换材料浸提液完成后，将96 孔板放入CO2培养箱中培养72 h。在浸提液刺激培养完成后，每实验孔再加入20 μL 的MTT 溶液，继续在CO2培养箱中培养4 h，然后弃置每孔中的液体，加入150 μL 的二甲基亚砜，室温震荡5 min 后以630 nm 的波长测定其吸光度，得到OD(optical density)值，用ρ 表示。根据国家标准[13]计算细胞相对增殖率(relative growth rate,RGR)，用R 表示，公式为：

式中：ρ 为试验组OD 值；ρ0为空白组OD 值。

1.2.3 材料对细胞的直接接触实验

将L929 细胞接种于培养皿中，每个培养皿加入11 mL 的细胞悬液，在CO2培养箱中培养24 h，待培养皿中的细胞贴壁生长良好后加入清洗、灭菌和干燥后的4 种单相炭材料，使炭材料与细胞直接接触，在CO2培养箱中进行刺激培养。刺激培养时间分别为24，72，120 和168 h，采用倒置生物显微镜对L929 细胞的生长形貌进行观察。

2 结果

2.1 4 种炭材料表面颗粒脱落实验结果

2.2 细胞毒性结果

评价生物植入材料对细胞的毒性常采用MTT 法。表2 所列为4 种材料的细胞毒性实验的RGR 值以及对应的毒性等级。

图1 单相炭材料颗粒脱落变化曲线Fig.1 Curves of single-phase carbon materials particles shedding

表1 4 种材料颗粒脱落的统计结果Table 1 Statistical results of particles shedding of four materials Unit: mg

表2 4 种材料的RGR 值和细胞毒性等级Table 2 Values of RGR and cytotoxicity grade of four materials

由表2 可知，在材料浸提液刺激培养时间一致的条件下，4 个实验组的RGR 值均随着材料浸提时间的增加而下降，可以判定随材料浸提时间增加，材料对细胞的毒性逐渐增强，其中树脂炭RGR 值最高，细胞毒性最小；石墨的RGR 值最低，细胞毒性最大；炭纤维和热解炭介于两者之间。整体来看，4 个实验组的RGR 值均大于75%，细胞毒性等级均为1 级，可视为无毒。

2.3 细胞直接接触

图2 所示为4 种材料与细胞直接接触后的细胞生长形貌。正常的细胞形状为梭形，与空白组相比，在最初的24 h 时，树脂炭组的细胞多呈梭形状，到168 h时，细胞数量为4 个实验组中最大。4 种材料中，石墨细胞数量最少，受材料抑制生长增殖程度最大。到168 h，各试验组细胞数目明显增多且表现为典型的贴壁生长。对比相同培养时间内的4 个实验组与空白组，实验组的细胞数量均小于空白组，说明材料的加入抑制了细胞的生长与增殖。从细胞的绝对数量上来看，石墨对细胞的生长增殖抑制程度最大，其次是热解炭，再则炭纤维，抑制程度最轻是树脂炭。

图2 直接接触细胞的生长形貌Fig.2 Direct contact with the cell morphology in the experiment

2.4 细胞超微结构

细胞是生物机体结构和功能的基本生命单位，细胞膜是细胞内环境与细胞外环境的分界，能够防止细胞外的物质进入细胞内部破坏细胞内环境的稳态，从而影响细胞内各细胞器的正常代谢功能，进而影响细胞的生长增殖以及凋亡。图3 所示为不同材料颗粒刺激下的L929 细胞超微结构图。正常细胞超微结构如空白组所示，细胞膜与核膜清晰可见，细胞呈光滑规整的椭圆形，各细胞器均匀地分布于细胞质基质中，各细胞器的代谢功能正常，细胞生长增殖正常。

细胞刺激培养24 h，在树脂炭、炭纤维、热解炭和石墨组里均可以看到有材料的颗粒进入细胞内部，囊泡包裹颗粒并对颗粒进行转运。与空白组对比，4个实验组细胞的细胞核核膜出现了轻微的皱缩、囊泡集中、核糖体聚集以及细胞质基质的颜色较空白组加深的现象，说明细胞对进入细胞的材料颗粒产生了应激反应。

细胞刺激培养72 h 后，可以观察到实验组的细胞核内颜色加深变黑，这是在材料颗粒刺激下，细胞染色质基质颜色加深，4 个实验组囊泡集中现象也更加明显，同时有颗粒进入线粒体，线粒体出现肿大。在此阶段的4 个实验组中材料颗粒对细胞超微结构影响最大的是石墨实验组，主要表现为石墨组的囊泡集中数量最多，面积最大，细胞膜与核膜皱缩现象最为严重。树脂组细胞与空白组细胞的形态最为接近，这说明树脂炭对细胞超微结构影响最小。

在材料对细胞刺激培养120 h 后，石墨实验组细胞膜打开，细胞质基质与细胞间环境直接相连，发生裂解，变白[14]，在图3 中表现为细胞膜内外的颜色趋于一致。细胞质基质是细胞新陈代谢的主要场所，细胞质基质裂解则说明细胞代谢的主要场所遭到破坏，细胞将会死亡。而树脂炭、炭纤维和热解炭实验组在材料刺激培养的120 h 后，与72 h 相比，细胞膜虽然保持完好，但细胞膜与核膜均更加皱缩，同时伴有线粒体肿大，说明细胞在材料颗粒的刺激下生长状态逐渐恶化。

在材料刺激培养的168 h 后，热解炭实验组细胞的细胞膜打开，在图3 中可以看到细胞出现明显大区域白色，说明染色质基质与细胞质基质出现明显裂解，细胞死亡。树脂炭与炭纤维组均出现大量的囊泡集中现象，炭纤维实验组囊泡集中现象尤为明显，两个实验组细胞均畸形生长，细胞处于濒临死亡状态。

3 讨论

细胞膜是保持细胞内环境稳态的一道重要屏障，正常情况下细胞膜具有一定的选择透过性，即有利于自身的物质可以通过而不利的则不能通过。但在病理情况下，细胞膜的选择通过性下降，有利的和不利的物质都可以通过，造成细胞代谢紊乱。进入细胞内的颗粒首先吸附在细胞膜表面，然后进入细胞内部[15]，当颗粒吸附在细胞膜表面时会使得细胞膜受到损伤、选择通透性发生改变：既不能把有害物质抵挡在外，也不能正常地选择性吸收细胞所需的营养物质，造成酶的活性下降，细胞代谢速率减慢，代谢废物淤积从而导致细胞死亡。

当颗粒进入细胞后，依次会进入到各细胞器中，由图3 可以看到囊泡包裹颗粒、囊泡集中、核糖体聚集使得细胞质基质颜色加深、线粒体肿大等细胞的应激变化。当线粒体被破坏时，细胞会启动线粒体自噬这一过程来降解受损的线粒体[16]，并通过细胞溶酶体消化[17]。线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，为细胞的生命活动提供能量，是细胞的能量站。过多线粒体的自噬将导致细胞生长不良或畸形，抑制细胞正常的生长增殖，并最终导致细胞的死亡。

杨辉等[18]使用5～20 nm 的纳米炭颗粒对小鼠胚胎成纤维细胞进行刺激培养，同时设置空白组，利用CASP 软件分析纳米炭颗粒对细胞DNA 的损伤，以细胞尾部DNA 含量变化来评价细胞DNA 的损伤程度。由荧光显微镜所拍的胶片结果显示，空白对照组细胞无彗尾出现，而炭纳米颗粒实验组出现了明显的彗尾，实验组彗尾部DNA 含量明显高于空白组。并且炭材料颗粒剂量越大，尾长越长，彗尾DNA 含量越高，表明细胞内部的DNA 损伤程度越大。这个现象在有些文献中被描述成出牙或形成凋亡小体[19]。细胞活检结果显示：随炭颗粒对细胞刺激时间延长，细胞活性逐渐下降，炭纳米颗粒造成小鼠胚胎成纤维细胞的DNA 损伤最终造成了细胞死亡。韩丹等[20]将5 μm 炭纤维复合材料颗粒刺激小鼠肺成纤维细胞，同样进行彗星试验去检测材料对细胞DNA 的损伤程度，也发现类似结果。从上述的实验结果中可以看出，无论是5～20 nm 的炭颗粒还是5 μm 的炭纤维复合材料颗粒均会造成细胞DNA 的损伤，并且炭材料颗粒对细胞刺激时间越长以及炭材料颗粒剂量越大，DNA 损伤越严重。本实验发现4 种单质炭材料的表面颗粒脱落的总量越大，对细胞刺激的时间越长，细胞生长状况越差。论文中进入到细胞内的颗粒尺寸在54～96 nm 之间，这些颗粒进入细胞以后将损伤到细胞的DNA。当细胞的DNA 受损时，细胞会抑制自身的生长增殖，然后进行DNA 的修复。如果DNA 损伤不断加剧、仅靠细胞自身的能力已无法修复，将导致细胞的形态和代谢功能异常，使得细胞畸形生长甚至死亡[21]。